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1、罗氏 tunel 检测细胞凋亡试剂盒说明书注意： Label 溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。试剂盒组成：小瓶 /盖子标签内容物1 蓝色酶溶液大肠杆菌重组牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶，在 storage buffer 中10conc. 550ul2 紫色标记溶液在 reaction buffer 中的核苷酸混合物1conc. 5550ul3 黄色转化 -POD 抗荧光素抗体，绵羊Fab 片段，连接有辣根过氧化物酶Ready-to-use 3.5ml 需要自己配置的其他物品：除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。下表列出
2、每步所需物品概览：步骤设备试剂样品准备section 3.2 黏附细胞， 细胞涂片和细胞离心涂片准 备section3.2.1 冰冻组织section3.2.2.2 Washing buffer ：磷酸缓冲液PBS* Bloking buffer封闭缓冲液：溶于甲醇的3%H2O2 Fixation solution 固定剂：溶于PBS 的 4%多聚甲醛，ph7.4，新鲜配制Permeabilisation solution 渗透溶液：溶于0.1%柠檬酸钠 的 0.1%Triton X-100 ，新鲜配制（6）固定剂石蜡包埋组织section3.2.2.1 二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，8
3、0%，70%，溶于双蒸水中）Washing buffer ：PBS* 蛋白酶 K* ，不含核酸酶， 工作浓度： 10-20ug/ml ，溶于10mM Tris/HCL中， ph7.4-8 替代处理方案渗透溶液：（0.1%Triton1） X-100，溶于0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制胃蛋白酶 *（0.25%-0.5% ，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋白酶 *， 0.01N HCL ，不含核酸酶0.1M 柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射标记步骤section3.3 阳性对照section3.3.1 微球菌核酸酶或DNase I，重组，级别1* 黏附细胞， 细胞涂片和细胞 离 心 涂 片 和 组 织sec
4、tion3.3.2 Parafilm 石蜡封口膜或盖片湿盒Washing buffer ：PBS* Difficult tissue 困难组织塑料容器微波湿盒Citrate buffer 柠檬酸盐缓冲液，0.1M ，ph6.0 Washing buffer ：PBS* Tris-HCL ，0.1M ph7.5 ，含 3%的 BSA* 和 20%正常牛血清信号转换section3.4 湿盒Parafilm 石蜡封口膜或盖片Washing buffer ：PBS* DAB Metal Enhanced Substrate Set*DAB金属增强底物 *或 POD 底物替代物光镜镜检封固剂产品概述：
5、特异性： TUNEL 反应优先标记凋亡产生的DNA 链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA 链断裂可能缺失或不完全。空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT 到达 DNA 断裂处。两种情况均能产生假阴性。假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA 片段DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，细胞形态评估是一项重要的参数样本：细胞离心涂片和
6、细胞涂片在 chamber slides 上培养的黏附细胞冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本分析时间： 2-3 小时，除外培养、固定和渗透检测次数：一个试剂盒50T 试剂盒存储 /稳定性：未开封试剂盒储存于-15-25 可稳定至标签上标明的效期。试剂储存和稳定性TUNEL 反应混合物TUNEL 反应混合物应在用前临时配制，不能储存TUNEL 反应混合物用前应置于冰上转化 -POD 一旦融化转化-POD 溶液后，应储存于2-8（最长稳定6 个月）注意：禁止冰冻结冰优点：优点特点灵敏在单个细胞水平检测细胞凋亡的早期间断特异对坏死来说，优先标记凋亡快速分析时间短（2-3h）简便试剂稳定、优化，没有稀释
7、步骤灵活适合于固定细胞核组织，允许堆积、贮存和转运样本双染可以鉴定细胞凋亡的类型和阶段Function-tested 功能检查对于大量的批号来说，每一批号均进行了功能检测步骤和所需材料： 1 流程图：2 样品准备2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片需准备的其他试剂：Washing buffer ：磷酸盐缓冲液（PBS）Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2 Fixation solution 固定溶液： PBS 配制的 4%多聚甲醛， ph 7.4，新鲜配制Permeabilisation solution 渗透液： 0.1%Triton1）X-100 溶于 0.
8、1%柠檬酸钠溶液中，新鲜配制步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。注意：固定和渗透另外两个细胞样本用于银杏和阳性对照步骤操作1 用新鲜配制的固定液固定风干的细胞样本，1h，15-252 用 PBS 冲洗玻片3 用封闭液孵育，10min，15-254 用 PBS 冲洗玻片5 用渗透液孵育，2min，置于冰上2-86 按 3.3 操作2.2 组织部分2.2.1 福尔马林 -包埋组织福尔马林包埋组织的预处理：可按4 种不同的方式预处理。如用蛋白酶K，不含核酸酶，浓度、孵育时间和温度应按组织类型优化注意：只用罗氏应用科学的蛋白酶K， 因其经检测不含核酸酶，核酸酶可导致假阳性。另
9、外 3 中替代方法在下表中描述（step 2）需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中）Washing buffer ：PBS 蛋白酶 K，不含核酸酶，工作浓度：10-20ug/ml ，溶于 10mM Tris/HCL中， ph7.4-8 替代处理方案渗透溶液：0.1%Triton1）X-100，溶于 0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制胃蛋白酶 * （ 0.25%-0.5%， 溶于盐酸中， ph2） 或胰蛋白酶 *， 0.01N HCL ，不含核酸酶0.1M 柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射步骤：下表描述了用蛋白酶K（不含核酸酶）和3 中替代方法预处理福尔马林
10、-包埋组织的方法注意：加入额外的组织用于阴性和阳性对照步骤操作1 按照标准操作脱蜡和再水化组织（e.g. 60加热， 二甲苯浸洗， 一系列梯度酒精和双蒸水再水化2 用蛋白酶K 工作液于21-37中孵育 15-30min 替代方法操作1.渗透液孵育 8 min 2. 胃蛋白酶或胰蛋白酶37孵育 15-60min3.微波射线将玻片置于含有200ml 0.1 M柠檬酸盐缓冲液，ph6.0的塑料容器中350 W 微波放射5 min 3 用 PBS 冲洗两次4 按 3.3 操作2.2.2 冰冻组织处理（略）3 标记草案3.1 开始之前准备 TUNEL 反应混合液： 每一对管子 （小瓶 1：酶溶液， 小瓶
11、 2：标记溶液） 足以用于50ul反应体系的10 张片子，和2 个 50ul 标记溶液的阴性对照。注意：TUNEL 反应混合液应于用前临时配制，不能储存。 TUNEL反应混合液用前置于冰上步骤操作1 取 100ul 标记溶液（小瓶2）用于阴性对照2 加入总量50ul 的酶溶液（小瓶1）于 450ul 的标记溶液中，以获得500 ul TUNEL反应混合液3 充分混匀需准备的其他试剂：微球菌核酸酶或DNase I，重组，级别1* 对照：每次实验应包含两个阴性对照和一个阳性对照应阴性对照孵育固定和渗透的细胞于50ul/标记溶液中（无末端转移酶），替代用TUNEL反应混合液孵育阳性对照孵 育固定和渗
12、透的细胞于微球菌核酸酶或DNase I ， 重组 ，级别1 中（3000U/ml-3U/ml 于 50mM Tris-HCL中，ph7.5， 10mM MgCL2 ， 1mg/ml BSA ）10min，15-25，以诱导在标记前DNA链断裂3.2 黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案需准备的其他设备和试剂：Washing buffer ：PBS 湿盒Parafilm 石蜡封口膜或盖片步骤：参考下表步骤操作1 用 PBS 冲洗两次2 使样品周围区域变干3 加入 50ul TUNEL反应混合液于样品上注意：阴性对照加入50ul 标记溶液。 确保 TUNEL 反应混合液均匀分布于单层细胞
13、上，避免蒸发丢失。孵育时样品上应覆盖Parafilm 石蜡封口膜或盖片4 在湿盒、暗室 中加盖孵育60min，375 用 PBS 冲洗 3 次6 可在样品上加入1滴 PBS， 于荧光显微镜下观察。 激发光波长 450-500 nm， 在 515-565 nm（绿色）范围类检测3.3 困难组织标记草案（略）3.4 信号转换需要准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS 湿盒Parafilm 石蜡封口膜或盖片DABA底物或 POD 替代底物光镜镜检封固剂步骤：按照下表操作步骤操作1 使样品周围区域变干2 加入 50 ul 转化 -POD（小瓶 3）于样品上注意：确保转化-POD 溶
14、液均匀分布于单层细胞上，避免蒸发丢失。孵育时样品上应覆盖Parafilm 石蜡封口膜或盖片3 在湿盒 中孵育 30min ，374 用 PBS 冲洗 3 次5 加入 50-100ul DAB 底物或 POD 替代底物6 于 15-25孵育 10min7 用 PBS 冲洗 3 次8 用玻璃盖片封固（e.g. 用 PBS/甘油） ，光镜下检查替代方法：光镜检查前可复染4. 附件：4.1 Troubleshooting 问题步骤 /试剂可能原因建议非特异性标记包埋组织紫外辐射用于包埋组织的聚合（ e.g.异丁烯酸盐导致DNA链断裂）使用不同的包埋材料或不用的聚合试剂固定酸性固定剂 （e.g. 甲安菲
15、他明，Carnoy s固定剂）使用 4%多聚甲醛使用福尔马林或戊二醛TUNEL 反应TdT 浓度太高用 TUNEL 稀释缓冲液1:2 至 1:10 稀释 TdT 浓度转化步骤内源性 POD 活性细胞渗透前， 浸入 3% H2O2 甲醇稀释液 10min，封闭内源性POD 抗 -银光素 -POD 非特异性连接用正常抗绵羊血清封闭用含 3% BSA 的 PBS 封闭 20min 减少转化溶液浓度50% 核酸酶某些组织（ e.g. 平滑肌，组织准备后很快出现DNA 断裂）取得器官后立即固定组织通过肝静脉灌注固定剂某些酶仍有活性用含有 ddUTP 和 dATP 的溶液封闭背景高固定福尔马林固定导致含有
16、黑色素前体的细胞黄染使用甲醇固定，但同时应考虑甲醇固定可能降低灵敏度TUNEL 反应对于乳腺癌，标记混合物浓度太高用 TUNEL稀释缓冲液使标记混合物浓度降低50% 转化步骤内源性 POD 活性细胞渗透前， 浸入 3% H2O2 甲醇稀释液 10min，封闭内源性POD 抗 -银光素 -POD 非特异性连接用正常抗绵羊血清封闭用含 3% BSA 的 PBS 封闭 20min 减少转化溶液浓度50% 样品支原体污染支原体检测试剂盒高增殖细胞双染， e.g.用 Annexin-V-Fluos 注 意 ： Measuring via microplate reader not possible because of too high background.
