酵母菌的培养和形态观察

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1、山 东 大 学 实 验 报 告 酵母菌的培养和形态观察 胡雪芳 201300261033 【 实 验目的 】 1. 了解 酵母 培养基 的 特点以及 酵母 的 培养 方法。 2. 学习并 掌握 酵母制片 方法 ， 观察 酵母的 个体形 态及死 活细 胞 区 分 。 3. 学习掌握 观察酵母的 出芽 生殖方 式。 4. 学习掌握酵母菌 子囊孢子 的观察 方法。 5. 学习 和掌握 酵母的菌落形 态 特征 。 【 实验 原理 】 1. 酵母菌 酵母菌 形态： 是多形的、 不运动 的 单细 胞 真核 微生物 ， 细 胞 核 与 细 胞质已 有 明显的分化，菌 体比细 菌大。 酵母菌 繁殖： 繁殖方式

2、也 比较复 杂， 无 性繁殖 主要是 出芽 生 殖 ， 仅 裂殖酵母 属是 以 分裂方式 繁殖； 有性生 殖是通 过质配 、 核配 和 减 数 分 裂而产生的子囊孢子。 图 1. 典型 酵母（酿酒酵母）生活史 山 东 大 学 实 验 报 告 2. 子 囊 孢子 子囊孢子是 子囊菌类真菌有性生殖产生 的有性孢 子。在酵母菌 中 ， 能否形成子囊孢子及其形 态是酵 母菌分 类鉴定的 重要依 据之 一 。 酵 母 菌 形成 子囊孢子需要一定 的 条件 ， 所以 对不同 种属的 酵母要 选 择 适 合 形成子囊孢子的培养基。 麦氏培 养基 有 利于 酿 酒酵母 子囊孢 子 的 形 成 。 3. 美蓝

3、染色 本实验 通过美蓝 染色浸片 来 观察生活的 酵母形态 和出芽生 殖 方 式 。 美蓝为无 毒性染料， 其 氧化型为蓝 色， 而还原型 为无色。 用它 对 酵母菌染 色时， 由于活 细胞的新陈 代谢作用， 使 细胞内具有 较强的还原能力， 能使美 蓝从蓝 色的氧 化型变 为无色 的还原 型 ， 所 以 酵母的活细胞无色； 对于 死细胞 或代谢 缓慢的 老细胞 ， 则因 它 们 无 此 还原能力或还原能力 极弱 ， 而被 美蓝染 成蓝色 或淡蓝 色。 因 此 ， 用美 蓝水浸片不仅可观察酵母 的形态 ，还可 以区分死 、活细 胞。 山 东 大 学 实 验 报 告 【 实验 材料 】 1. 菌

4、株 表1. 菌株 。 编码 菌株 拉丁文 1 普通酿酒 酵母 Saccharomyces cerevisiae P1 2 安琪酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae A1 3 贝酵母 Saccharomyces bayanus 2. 培养基 表 2. 培养基 配方 编码 培养基 1 麦芽汁培养基 麦芽汁：150mL 琼脂：3g pH 自然（约6.4 ） 灭菌：1.05kg/cm2 ，20min 2 YEPD 培养基 酵母膏：1% 蛋白胨：2% 葡萄糖：2% pH：6.0 灭菌：121 ，15-20min 3 麦氏琼脂培养基 葡萄糖：1.0g 酵母浸出物：2.5g 乙酸钠：8

5、.2g KCl：1.8g 蒸馏水：1000mL 琼脂：15-20g 灭菌：15 磅，15min 3. 实验 试剂 表3. 实验试剂及 其配方 。 编码 试剂 配方 1 生理盐水 0.850.9% 的氯 化钠 溶 液 2 美蓝染液 将 0.5% 的 溶液 稀 释成0.1% 吕 氏碱 性 美蓝 染 液 3 水- 碘溶液 将革兰氏染色中的卢戈氏 碘液稀 释 4 倍 4 芽孢染色液 5% 孔雀绿、0.5 沙黄 水溶 液 、95% 乙醇 脱色 液 4. 其他 普通光学显微镜 、吸水纸 、 载玻 片、酒 精灯、接 种环 等 。 山 东 大 学 实 验 报 告 【实验 步骤 】 1. 麦芽汁 培养 基的配

6、制 （1 ） 取 大麦或小麦若干，用水 洗净， 浸水 6-12 小时 ，置 15阴暗 处 发芽 ，上面盖纱布一块，每日 早、中、 晚 淋水一 次， 麦 根 伸 长至麦粒的两倍时， 即停止 发芽， 摊开 晒干或 烘干， 贮 存 备 用 。 （2 ） 将 干麦芽磨碎， 一份麦 芽加四份 水， 在65 水 浴中 糖 化3-4 小 时 ，糖化程度可用碘滴定 之。 （3 ） 将 糖化液用 3-4 层 纱布 过滤，滤 液如混 浊不清 ，可用 鸡 蛋 白 澄 清， 方法是将一个鸡蛋白 加水约20mL ， 调匀至 生泡沫 为 止 ， 然 后倒在糖化液中搅拌煮沸 后再过 滤。 （4 ） 将 滤液 稀释 到 5-

7、6 波 美度 ，pH 约 6.4 ， 加入2% 琼脂 即成 。 1 21 灭菌30min 。 2. 酵 母 菌的一般 培养 将 酵母菌 A 和酵母菌 B 分 别利用分 区划线 方法接 种到 YEPD 培养基 上 ，在 28-30 恒温 培养箱 中，倒 置培养1-2 天 。 图 2. 分区 划线法示意图 起点 山 东 大 学 实 验 报 告 3. 酵 母 子囊孢 子 的诱 导产生 （1 ） 菌体活化 ：将菌株分别接 种到 YEPD 平板，28-30 ，倒置培养 1-2 天 。 连续 传代2-3 次 ， 产生健 壮和旺 盛的活力 细胞。 （2 ） 饥饿处理 ：取 适量 活力酵母菌细 胞，用手 敲击

8、使之 在生理盐水 中做成均匀细胞悬液。 （3 ） 生孢诱导： 取一滴或一接种环菌 悬液滴在 麦氏琼脂 平板 上 ， 静 置几分钟， 使菌液浸入琼脂 中， 不要旋 转或者 斡旋平 板。 25 ， 培养 7 天 。 4. 酵 母 菌制片 与 简单 染色 美蓝 染液水 浸片 法 （1 ） 取干净 载玻片， 滴加一 滴 0.1% 吕氏 美蓝染 液 于 载 玻片 中 央 ，无 菌操作取 YEPD 平板上38-30 培养1-2 天 的培 养物适 量 ， 涂 抹 于染液中，做成分散的细 胞悬液 。 （2 ） 用 镊子取 一 盖玻片，将盖玻片一 边 与菌液 接触，缓 慢将 盖 玻 片 倾斜并覆盖在菌液上。 （

9、3 ） 将 制片 放置约 3 分钟 后 ， 用 低倍 镜 及 高 倍镜观 察酵母 菌 形 态 和 出芽情况，并根据细胞颜 色区分 死细胞 和活细胞 。 （4 ） 染色30 分钟后 ， 再 次观察 ， 注 意死活 细胞的 比例是 否发 生 变 化 。 水- 碘溶液水浸片步骤 与美蓝 水浸片 制片方法 相同。 5. 酵 母 子囊孢 子 染色 孔 雀绿染 色法 （1 ） 取干净 载玻片 ，滴加一滴 蒸馏水 ，无菌 操作取 第 3 步 诱导后培 养物适量 ， 涂抹于水中，做成分 散的细胞 悬液，涂 片干 燥 和 加 热固定。 山 东 大 学 实 验 报 告 （2 ） 用5% 的 孔雀绿染 色 1-2

10、分钟 ， 然后水 洗； （3 ） 用95% 的乙醇 脱色30 秒 ，水洗 ； （4 ） 用 0.5% 的番 红水溶 液复染 1-2 分钟 ，水洗 ，滤纸 吸水 ， 干 燥 。 （5 ） 镜检，先用低倍镜观察， 再用高 倍镜观 察，最后 用 油镜 观察 。 【 实验 结果 】 1. 酵母的 培养 特征 酵母 菌 A ：米黄色， 表面 光 滑湿润 ，凸起 ，边缘光 滑近圆 形，不 透明，发酵 味道浓郁， 单 菌落大 小不一 ，易挑起 。 酵母菌 B ：米黄色， 表面光 滑湿润 ， 凸起 ，边缘光 滑近圆 形， 不 透明 ，发酵味道浓郁， 单 菌落大 小不一 ， 易挑起 。 图3. 酵母 平板 图

11、左 是安琪酵母，图右是 贝酵母 。 2. 酵母 细胞形 态 与出 芽生殖 本实验 通过美蓝 染色浸片 来 观察生活的 酵母形态 和出芽生 殖 方 式 。 0.1% 美蓝水浸片 的观察结果如下 。 山 东 大 学 实 验 报 告 图4. 安琪酵母 美蓝 染色结果 （10*40 倍 ） 图 4 中 是安琪酵 母 0.1% 美蓝 染色3min 和 染色30min 后 细胞存活 数量的对比图。A 是 美蓝染 色 3min 后 安琪酵母死活细胞的状态，C 是 A 的局部放大图 。B 是美 蓝染色30min 后 安琪酵母死活细胞的状 态，D 是 B 的 局部放 大图。 通过 图 4 中 C 和D 我们 可

12、以看 到， 与3min 相比 ， 将 美蓝染色水 浸片 放置30min 后 ， 视野中 蓝色和淡蓝色的细 胞数量 明显增 加， 说 明 死细胞 的 比例增加。 山 东 大 学 实 验 报 告 图 5. 贝 酵母 美蓝 染色结果 （10*40 倍 ） 图 5 中 是 贝 酵母0.1% 美蓝染 色 3min 和 染色 30min 后 细胞存活数 量的对比图。A 是美 蓝染色3min 后 安琪酵母死活细胞的状 态，C 是 A 的局部放大图。B 是 美蓝染 色 30min 后 安琪酵母死活细胞的状 态，D 是 B 的 局部放 大图。 通过 图 5 中 C 和D 我们 可以看 到， 与3min 相比 ，

13、 将 美蓝染色水 浸片 放置30min 后 ， 视野中 蓝色和淡蓝色的细 胞数量 明显增 加， 说 明 死细胞 的 比例增加。 山 东 大 学 实 验 报 告 图 6. 酵母 美蓝染色结果 （10*100 倍 ） 图 6 中 是 酵母0.1% 美 蓝染色 结果。图 A 是安琪 酵母 染色结 果，图 B 是贝酵母染色结果 。 通过 图 6 ， 我们可 以观察 到 安琪 酵母细 胞为圆形 、椭圆 形，出 芽 生殖。贝 酵母 圆形 或近圆 形，出 芽生殖 。 3. 酵 母 细胞 和 子囊孢 子 本实验 通过 孔雀绿 来 观察 生活的 子囊孢 子 。 孔 雀绿 的 观察结 果 如 下 。 图 7. 酵

14、母 孔雀绿 染色结果 （10*100 倍 ） 图 7 中 是 酵母孔雀 绿 染色 结果。图 A 是 安琪 酵 母染色 结 果 ， 图B 是 贝酵母染色结果。 红色部分 是酵母 细胞， 绿色 部分 是子囊 及子 囊 孢 子 。 山 东 大 学 实 验 报 告 贝 酵母的子囊及子囊孢子 数目 占 总细胞 的比例较 大。 【 分析 与讨 论 】 注意事项 ： 1. 用接种环 将菌体与染液混 合时不 要剧烈 涂抹，以 免损坏 细胞 。 2. 滴加染液 要适当， 否则用盖 玻片覆 盖时， 染液过 多会溢 出， 过 少 会 产生大量气泡。 3. 盖玻片要 缓慢倾斜覆盖， 以免产 生气泡 。 分 析 讨论： 1. 根据观察 ， 吕氏碱性美蓝染 液作用 时间与 酵母菌 死 、 活细 胞 比例 变 化是否有关系？ 有 关系， 时间越长 则视野 中 死亡酵 母菌所 占比例 就越大 。 因为酵母 菌 处于吕氏碱性美蓝染液 中会脱 水， 导致 死亡， 时间越 长， 细 胞 死 亡数量就越多。