无菌检查操作规程

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1、无菌检测室消毒操作规程 1. 目的：建立一个无菌检测室消毒操作程序 2. 范围：适用于需消毒的无菌检测房间 3. 责任：质检科无菌岗位人员 4. 程序： 4.1消毒前准备和用具 4.1.1.能形成雾状的喷壶，配制消毒剂的器皿。 4.1.2配制用蒸馏水 4.2试液 4.2.1次氯酸钠，酒精， 4.1.2.灭菌生理盐水：0.9%氯化钠溶液 4.1.1.3 84消毒液（1:100）水溶液 4.1.2.4 500mg/L碘伏溶液 4.1.3培养基 4.1.3.1.培养基的制备培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配 制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在

2、225、避光的环境。 培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在 一年内使用。 4.1.3.1.1 硫乙醇酸盐流体培养基(用于培养好氧菌、厌氧菌)取硫乙醇酸盐流体培养基干粉29g(或照干粉培养基配制说明书进行配制)，加纯化 水1000ml，加热至溶解，分装，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧 化 层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。经115230分钟灭菌、备用。在供试品 接 种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100水浴加热至 粉红色消失(不超过20分钟)，迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。硫乙醇酸盐流体培养基置30

3、35培养。4.1.3.1.2 改良马丁培养基（用于培养真菌）取改良马丁培养基干粉28g(或照干粉培养基配制说明书进行配制)，加纯化水 1000ml，加热煮沸至全部溶解，分装，经115220分钟灭菌、备用。改良马丁培养基置2328培养。 4.1.3.1.3 营养肉汤培养基取营养肉汤培养基干粉18g(或照干粉培养基配制说明书进行配制)，加纯化水 1000ml，加热至全部溶解，分装，经115230分钟灭菌、备用。 4.1.3.1.4 营养琼脂培养基取营养琼脂培养基干粉31g(或照干粉培养基配制说明书进行配制)，加纯化水 1000ml，加热煮沸直至完全溶解，分装，经121215分钟灭菌、备用。 4.1

4、.3.2培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性 检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或供试品的无菌检查同时 进行。 4.1.3.3无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。 4.1.3.4灵敏度检查 4.1.3.4.1 菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷 冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 4.1.3.4.1.1金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B) 26 003 4.1.3.4.1

5、.2铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC(B) 10 104 4.1.3.4.1.3枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B) 63 501 4.1.3.4.1.4生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC(B) 64 941 4.2.4.1.5 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F) 98 001 4.1.3.4.1.6黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F) 98 003 4.1.3.4.2 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培 养

6、基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养 1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基 中，2328培养2448小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数 小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜 面培养基上，2328培养57天，加入35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。 然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管） 至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 4.1.3.4.3 培养基接种 取每管装

7、量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡 萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不作为空白对照，培 养 3天； 取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、 黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 4.1.3.4.4 结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检 查符合规定。 4.1.4稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 4.1.4.1 0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤

8、清，调 节 pH值至7.10.2，分装，灭菌。 4.1.4.2 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、 氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。 4.1.4.3如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂 等。 4.1.5方法验证试验 4.1.5.1原理4.1.5.1.1 当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合 于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。 4.1.5.1.2 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。

9、对每一试验 菌应逐一进行验证。 4.1.5.2菌种及菌液制备同培养基灵敏度检查。 4.1.5.3薄膜过滤法 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于 100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中， 或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对 照。按规定温度培养35天。各试验菌同法操作。 4.1.5.4直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合 直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养

10、基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、 黑曲霉各2管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度培养 35天。 4.1.5.5结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量 在 该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供 试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物微弱、缓慢或不生长，则供试品的 该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，或 使用中和剂或灭活剂如内酰胺酶、对氨基苯甲酸，或更换滤膜品种等方法，消除 供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。 4.1.5.6注意事项 方

11、法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。 4.2供试品操作 4.2.1厂内产品属大容量的供试品均系用薄膜过滤法 4.2.1.1需要设备：全封闭检测器、一次性过滤器 4.2.1.2产品取样量：玻瓶产品：每种培养基最少检验数量为10瓶。 塑袋产品：每批产品数量200袋时，每种培养基最少检验数量 为10袋；每批产品数量200袋时，每种培养基最 少检验数量为5%或2袋（取较多者） 。阳性对照：供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的 最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法， 应增加供试品1瓶（袋）作阳性对照。 4.2.1.3每管接种量：供试品装量在100ml-500ml，需接种全量；供试品

12、装量在500ml 以上，需接种1000ml。 4.2.1.4接种培养基量： 100ml 4.2.1.5阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品， 以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗 厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。 阳性对 照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查（大肠埃希菌的菌液制备同培养基的灵敏度检 查中的金黄色葡萄球菌），加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培 养基接种的样品量。阳性对照管培养4872小时应生长良好。 4.2.1.6阴性对照 4.2.1.6.1

13、 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性 对照不得有菌生长。 4.2.1.6.2 无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂。中和剂等试剂，应证明其 有效性，且对微生物生长及存活无影响。 4.2.1.6.3 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相 同。 4.2.1.6.4 操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。如果容器内有一 定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头），向供试品容器内导 入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。 4.2

14、.1.7具体操作见智能集菌仪标准操作规程。 4.2.1.8将硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及阳性对照管用培养基分别加至经 药液过滤后的一次性薄膜过滤器内，取下细菌和真菌分别经3035和2328培养 14天后观察结果。 4.2.1.9培养及观察 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否 有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能 从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接 种于斜面培养基上，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否 再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染

15、色，镜检，判断是否有菌。 4.2.1.10结果判断 4.2.1.10.1若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定； 若 供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明 试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判 试验结果无效： 4.2.1.10.1.1无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的 要求； 4.2.1.10.1.2回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素； 4.2.1.10.1.3阴性对照管有菌生长； 4.2.1.10.1.4供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验

16、中所使用的物品 和（或）无菌操作技术不当引起的。 4.2.1.10.2试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。 4.2.2包装材料操作 4.2.2.1无菌加药接头操作 取无菌加药接头7只，5只分别放入硫乙醇酸盐流体培养基中，其中1管接种金黄色 葡萄球菌菌液1ml，供作阳性对照；另外2只直接放入改良马丁培养基内，培养基分装 量为40ml。 4.2.2.2一次性使用输液器操作 取三只供试品，接管内表面积每10cm 2 流过管内腔1ml0.9%氯化钠溶液浸提介质， 流量为10ml/min。供试液应在制备后2h内使用，每批供试液分别接种于硫乙醇酸盐流 体培养基5管，其中一管接种金黄色葡萄球菌菌液1ml，供作阳性对照；另接种于改良 马丁培养基2管，培养基分装量为40ml，每管接种量5ml。 4.2.2.3废液袋及引流系统操作 取三只供试品，按容器内表面积10cm 2 加入0