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1、1 与灵芝三萜合成相关的细胞色素 P450 单加氧酶基因的克隆 摘要：灵芝(Ganoderma lucidum) 是我国最著名和最具经济价值的药用真菌，灵芝三萜是灵 芝的主要有效成分之一，具有抗肿瘤和免疫调节等多种功效，是新药研发的重要源泉。但 是其单体难以通过化学分离或合成方法大量获得已成为灵芝三萜类药物研发的主要瓶颈， 采用合成生物学思路在微生物中构建异源次生代谢途径是解决这一问题的有效途径。这一 策略首先要解决的问题是灵芝三萜次生代谢途径中关键酶基因的获得及功能描述，细胞色 素P450单加氧酶便是该途径中最为重要的关键酶之一。本实验根据由灵芝全基因组序列分 析获得的细胞色素P450候选基
2、因序列设计引物，以灵芝菌丝cDNA 为模板进行PCR 扩增 反应，成功获得单一的扩增产物，且其大小与预期相一致。进一步通过T - A 克隆、大肠 杆菌转化、菌落PCR 及测序等工作验证其序列正确性，最终挑选出一条与原始序列完全一 致的单克隆，可用于后续表达及功能验证等相关研究。鉴于细胞色素P450 在灵芝三萜生 物合成途径中发挥的巨大作用，本实验所获之克隆可以为灵芝三萜合成生物学研究提供重 要的数据参考和借鉴。 关键词：灵芝三萜；细胞色素P450；基因克隆；合成生物学2 Cloning of Cytochrome P450 monooxygenase involved in the biosy
3、nthesis of triterpenoids from Ganoderma lucidum Abstract：Ganoderma lucidum is the most famous medicinal fungus with the most economic value in China. Triterpenoids are one of the major group of bioactive components found in G. lucidum. Modern pharmacological research has demonstrated that G. lucidum
4、 triterpenoids have multiple therapeutic actions, including antitumor and immunomodulatory activities, suggesting they are important source for R cytochrome P450; gene cloning; synthetic biology3 引言 灵芝为担子菌纲(Basidiomycetes) ，多孔菌科(Polyproraceae)灵芝属 (Ganoderma)真菌赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(G. Japonicum)的总
5、称。灵芝 作为我国传统的药用真菌，几千年来一直被用于疾病治疗和延长寿命，具有悠 久的药用历史 1-2 。对于灵芝的药用记载最早出现在两千多年前的神农本草经 中，目前灵芝已被美国草药药典与治疗纲要 （American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium ）收录 3 ，其药用价值已得到世界各 国的广泛认可。灵芝中含有多种生物活性物质，截止目前，已有400多种不同的 化合物被鉴定出来 4 ，包括150余种萜类化合物 5 、灵芝多糖、蛋白质、生物碱、 氨基酸等，因此灵芝又有“生物活性成分细胞工厂”之称 2 。现代药理学研究 已经证明，灵芝具有
6、多种重要的医学价值 2, 5-10 ，例如抗肿瘤 8-10 、降血压、抗 病毒以及增强免疫能力等，其在疾病治疗、新药研发等领域中具有广阔的应用 前景。 1 灵芝三萜生物合成途径及关键酶 灵芝三萜与灵芝多糖是灵芝药用活性成分的主要组成部分。同位素标记实 验显示：灵芝三萜通过甲羟戊酸途径（Mevalonic Acid Pathway ，MVP ）合成 4, 11-12 ，羊毛甾醇是所有灵芝三萜和麦角甾醇（真菌细胞膜的重要组分）的共同 环状前体，但是目前对于灵芝三萜下游特异性合成途径的研究还是空白，对于 从单一前体羊毛甾醇形成种类繁多的灵芝三萜的分子机制还不清楚 11 。中国医 学科学院药用植物研究
7、所陈士林课题组分析了所有已知灵芝三萜的结构和基团 修饰，首次提出了灵芝三萜的完整合成途径，并认为参与灵芝三萜下游途径的 修饰酶主要来自于细胞色素P450单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenases，CYP450） 、乙酰基转移酶（Acetylase，AT）和甲基转移酶 （Methyltransferase，MT ）等超基因家族。 灵芝三萜生物合成的甲羟戊酸途径（MVP）主要分为三个阶段：以糖酵 解产物乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）作为原初底物，经过甲羟戊酸（Mevalonic Acid，MVA ）中间产物合成异戊烯基焦磷酸( Isopentenyl diphosp
8、hate，IPP )和 , - 二甲丙烯基焦磷酸( Dimethylally diphosphate，DMAPP )；经过烯丙基转移 酶（Prenyltransferase）和萜类环化酶的催化生成2 , 3 - 氧化鲨烯（2，3-4 oxidosqualene） ；由氧化鲨烯环化酶（Oxidosqualene cyclase，OSC）催化 2 , 3-氧化鲨烯生成羊毛甾醇（Lanosterol ） 。羊毛甾醇再经过一系列的氧化、甲基 化、乙酰化等步骤，生成种类繁多的灵芝三萜类化合物，催化这些反应的主要 酶类就是CYP450 以及甲基转移酶（MT） 、乙酰基转移酶（AT）等。 灵芝三萜生物合成途
9、径相当复杂，参与其中的关键酶、限速酶亦数目繁多。 3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶 A 还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR ）催化 3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶 A （HMG - CoA ）形成甲羟 戊酸（MVA） ，是萜类合成途径中最早起作用的关键酶，也是第一个限速酶 13 。 法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase，FPPS ）催化一分子的异戊 烯基焦磷酸（IPP）和牦牛儿基焦磷酸（Geranyl pyrophosphate，GPP ）合成法 呢基焦磷酸（FPP ） ，该基因受
10、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate ，MeJA）诱导表 达量升高 14 。鲨烯合成酶（Squalene synthase，SQS）催化两分子的法呢基焦磷 酸（FPP）中间体缩合生成鲨烯，受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导 15 ，同时过表达 鲨烯合成酶（SQS）基因可使甾醇和三萜类化合物合成途径下游基因表达量上 调 16 ，如：鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase ，SE）基因、羊毛甾醇合成酶 （Lanosterol synthase ，LAS ）基因、细胞色 P450(CYP450)基因。鲨烯环氧酶 （SE）催化鲨烯生成 2,3-氧化鲨烯，是合成甾醇和三萜类化合物的第一步氧化
11、 反应，是该途径的限速酶之一，沉默或抑制 SE 的表达，会降低三萜化合物的 积累，对甾醇的合成并无影响 17 。氧化鲨烯环化酶（OSCs）家族催化 2, 3- 氧 化鲨烯环化生成结构、功能各异的植物甾醇和三萜类骨架，被认为是植物甾醇 和三萜化合物生物合成的关键分支点，羊毛甾醇合成酶（LAS）参与灵芝三萜 生物合成途径。羊毛甾醇合成酶（LAS）可催化 2, 3- 氧化鲨烯环化生成羊毛甾 醇，是进入灵芝三萜合成途径的第一个关键酶。其后 CYP450 与甲基转移酶 （MT） 、乙酰基转移酶（AT ）将对灵芝三萜碳环骨架进行一系列氧化、甲基化、 乙酰化等复杂的修饰，进而生成种类繁多的灵芝三萜类化合物单体。近年来，多位学者已经展开了对灵芝三萜合成的MVP 途径中关键酶基因 的克隆及特征描述等相关研究，并取得了显著的进展。Hongmei Luo 等构建了 灵芝子实体 cDNA 文库 18 ，并对其做表达序列标签（Expressed Sequence Tag， EST）分析。研究人员从文库中随机抽取了1023 个克隆，最终获得879 条高质量的ESTs，经序列比对后发现这些ESTs 与多种已知功能的基因具有极
