《大肠杆菌基因组dna的提取及荧光定量pcr试验设计》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠杆菌基因组dna的提取及荧光定量pcr试验设计（30页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、大肠杆菌基因组 DNA 的提取一、传统法提取大肠杆菌基因组 DNA。1、实验原理提取 DNA 的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶 K 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿 /异戊醇抽提分离蛋白质，得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀使 DNA 从溶液中析出。SDS 的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶 K 或链霉蛋白酶 E 均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取 DNA 的反应体系中，SDS 可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜
2、，并使组织蛋白和 DNA 分离；而蛋白酶 K 可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀 DNA。为获得高纯度 DNA，操作过程中常加入RNaseA 除去 RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将 CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀 DNA，而 CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去。2、实验试剂与仪器1）
3、实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB 液体培养基，TE 溶液，10%SDS，蛋白酶 K， 5mol/L NaCl， CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB 液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨 10 g/L，细菌培养用酵母提取物 5 g/L，NaCl 10g/L ，去离子水。(搅拌溶解后，用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容 100ml，用 20/50ml摇瓶分装 5 瓶，包扎好，在 121，1.034105 pa 高压下蒸汽灭菌 20min.)2）TE 缓冲液：1M Tri
4、s 溶液（取 Tris242.2g，加 ddH2O 至 1600ml，加热溶解）1M tris-HCl pH8.0 溶液（取 1M Tris 溶液 160ml 用分析纯盐酸调至 Ph=8.0（需浓盐酸约 8.5ml），加 ddH2O 定容至 200ml，高压灭菌备用） TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0 ，1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH =8.0 1ml 向烧杯中加入约 400mldd H2O 均匀混合;将溶液定容到 500ml 后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶 K：（20mg 蛋白酶 K 溶于
5、1ml 无菌双蒸水， -20备用）4）CTAB/NaCl 溶液：（5% w/v，5gCTAB 溶于 100ml 0.5M NaCl 溶液中，需加热到 65使之溶解，然后室温保存） 4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的 LB 培养基中，一级培养过夜，以 10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。2、取菌液 1.5ml 置于离心管中，以 5000rpm 冷冻离心 1min，弃上清液3、加 190 ul TE 悬浮沉淀，并加 10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入 1ul 蛋白酶 K（20mg/ml），混匀，37保温 1 小时。5、加 30ul 5 mol/L Na
6、Cl,混匀。6、加 30ul CTAB/NaCl 溶液，混匀，65保温 20min7、加入 300ul 酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp 离心 10min8、取上清液，加入 300ul 氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp 离心 10min9、取上清液，加入 300ul 的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止 10min，沉淀DNA，5000rmp 离心 10min10、加 500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp 离心 10min11、弃上清液，待酒精挥发尽后加 30ulTE 溶解12、溶解于 20ul TE 中，-20保存。二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组 DNA。
7、细菌基因组 DNA 提取试剂盒：1、TGuide 细菌基因组 DNA 提取试剂盒DP302-02 50 次 420 元2、TaKaRa 细菌基因组 DNA 小量纯化试剂盒TaKaRa DV810A 50 650 元3、Biomiga 细菌基因组 DNA 提取试剂盒GD2411-01 Bacterial gDNA kit 50 次 423 元GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250 次 1798 元4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒BSC12S1 50 次 400 元BSC12M1 100 次 750 元5、OMEGA 细菌基因组 DNA 提取试剂盒D33
8、50-00 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 5 210 元D3350-01 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 50 980 元D3350-02 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 200 3350 元荧光定量 PCR 试验（标准曲线法）定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应 (PCR) 的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 （靶）数量。其中靶可以是 DNA、 cDNA 或 RNA。【实验原理】在实时定量实验中，反应是在 PCR 产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的 PCR 产
9、物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。在 PCR 的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。该预定义的 PCR 循环范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度 （与基线循环相对应的 Rn 值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线。然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 （ delta Rn Rn 值）与阈值交叉的点。 Rn 值与阈值交叉的分数循环定义为 CT。一、试验设计使用 StepOne 软件中的 Design Wizard（设计导向）创建新实验1、定义实验属性在 Experiment Properties （实验属性）屏幕上
10、，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型。1）Experiment Name （实验名称）。2）Barcode （条码），然后输入您的 PCR 反应板上的条码。（可不填）3）User Name （用户名）。4）Comments （注释）。（可不填）5）选择 Quantitation （定量）实验类型6）Next （下一步）2、定义方法和材料在 Methods & Materials （方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和 PCR 模板。1）将 Standard Curve （标准曲线）选为定量方法。将 Standard Curve （标准曲线）选为定量方法。 标
11、准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。 从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。 当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。用于标准曲线实验的 PCR 反应包括以下组分： 样本 其中靶数量未知的样本。 标准品 数量已知的样本。 标准品稀释序列 一组用于构建标准曲线的标准品稀释液 （例如，1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32） 。 重复数 含有相同组分和量的相同反应数。 阴性对照 含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为 “ 无模板对照(NTC)”。阴性对照应不会扩增。2）为试剂选择 TaqMan Reagents （ TaqMan 试剂）（包括两个引物一个探针） 。如果
12、使用 TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择TaqMan Reagents （ TaqMan 试剂） 。 TaqMan 试剂包括两个引物和一个TaqMan 探针。 引物设计用于扩增靶。 TaqMan 探针设计用于杂交靶，并在扩增靶时产生荧光信号。切记！ Applied Biosystems 不建议将 TAMRATM 染料随 StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。如果使用 SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择 SYBR Green Reagents （ SYBR Green 试剂）。 SYBR Green 试剂包括两个引物和 SYBR
13、Green 染料。 引物设计用于扩增靶。 SYBR Green 染料可在结合到双链 DNA 时产生荧光信号。 SYBR Green 染料通常是添加到反应的SYBR Green 母液的一部分。 如果使用 SYBR Green 染料：选择 Include Melt Curve （包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。将 Standard （标准）选为升降温速度。 Applied Biosystems 不提供 SYBRGreen 试剂的 Fast 母液。3）为升降温速度选择 Standard (2 hours to complete a run) （标准 （约两小时完成运行） 。 如果为 PCR
14、 反应使用 Fast 试剂，则选择 Fast (40 Minutes toComplete a Run) （快速 （约 40 分钟完成运行） ）。 如果为 PCR 反应使用标准试剂 （包括 SYBR Green 试剂和 TaqMan 试剂），则选择 Standard (2 Hours to Complete a Run) （标准 （约 2 小时完成运行） 。4）为模板类型选择 gDNA (genomic DNA) （ gDNA （基因组 DNA） ） 。5）Next （下一步） 。3、设置靶在 Targets （靶）屏幕上，输入您想在 PCR 反应板中定量的靶数量，然后为每个靶设置检测。1）单
15、击 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? （您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入 1（根据需要填）。注意： 靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。2）选择 Set Up Standards （设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品。建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。注意： Set Up Standards （设置标准品）复选框默认情况下已选取。3）设置靶 1 检测：a. 单击 Enter Target Name （输入靶名称）单元格，然后输入 RNase P（示例） 。b. 从 Repor
16、ter （报告基团）下拉菜单中，选择 FAM （默认） 。 如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端，则选择 FAM。 如果要将 JOETM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端，则选择JOE。 如果要将 VIC 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端，则选择VIC。 如果您正使用 SYBR Green 染料以检测双链 DNA，则选择 SYBR 。c. 从 Quencher （淬火基团）下拉菜单中，选择 NFQ-MGB （默认） 。 如果要将非荧光淬火基团小沟结合物加在您正用于检测靶的 TaqMan 探针的 3 端，则选择 NFQ-MGB。 如果您正使用 SYBR Green 染料，则选择 None （无） 。4）Next （下一步）
