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1、苹果果皮中总黄酮的提取方法优化研究摘要：我们以控制变量的方法，以苹果果皮总黄酮得率为考察指标，对影响苹果皮总黄酮提取方法的因素进行了探讨，通过从苹果皮中提取出来的黄酮的吸光度描绘出的曲线判断其含量得出了苹果皮总黄酮提取的优化条件，从而找出它的优化方法并测定了苹果果皮中总黄酮的含量。结果表明，苹果果皮总黄酮提取的最佳实验条件为：水浴温度为 65，乙醇浓度为 65%，提取时间为 2h，pH=10，总黄酮得率为1.272%。关键词：苹果、总黄酮、提取方法前言 黄酮类（英语： Flavones）是一类基于 2-苯基色圆酮-4-酮（2-苯基-1-苯并吡喃-4-酮）骨架的黄酮类化合物。果中的重要抗氧化物质
2、来源。苹果皮的营养与经济价值：黄酮化合物是广泛存在水果和蔬菜中的一类次生代谢类物质，近来发现它们具有很强的清除自由基能力，是苹苹果皮中含有很多生物活性物质，例如：酚类物质，黄酮类物质，以及二十八烷醇等，这些活性物质可以抑制引起血压升高的血管紧张素转化酶，有助于预防慢性疾病，如心血管疾病、冠心病，降低其发病率。 此外，苹果皮的摄入可以降低肺癌的发病率。国外研究表明，苹果皮较果肉具有更强的抗氧化性，苹果皮的抗氧化作用较其它水果蔬菜都高。普通大小苹果的果皮抗氧化能力相当于 800mg 维生素 C 的抗氧化能力。 苹果皮中的二十八烷醇还具有抗疲劳和增强体力的功效。苹果皮可以抑制齿垢的酶活性及口腔内细菌
3、的生长，具有抗蚀作用，可以保护牙齿。还可以使皮肤白嫩，防止黑色素的生成，有美容功效。 苹果皮含丰富的膳食纤维，能帮助消化。苹果中将近一半的维生素 C 也在紧贴果皮的部位。苹果皮比果肉抗氧化性更强。 目前已经有很多厂家通过从苹果皮中提取生物活性物质来开发功能食品。苹果皮粉作为一种很有价值的食品添加剂，可以用其生产强化食品，少量地添加苹果皮粉就能够增加食品中的多酚类物质、黄酮类物质的含量。 1 实验目的（1）学习分光光度计的原理，加深掌握和熟悉了分光光度计的原理和使用操作。（2）了解了黄铜的结构和化学性质，学会了如何鉴定黄酮类化合物和学习植物中黄酮化合物的提取的一般方法，同时也了解了黄酮类化合物的
4、药性功效。（3）掌握标准曲线法测定原料药含量的方法及锻炼自己的实验操作技能。2 材料的选择研究表明，苹果果实中含有丰富的黄酮类物质，主要集中在果皮部分，果肉和果心中的含量远远小于果皮的黄酮含量。但是由于农药的残留、空气污染等诸多不利因素，人们在食用苹果时多将果皮弃去，却没有认识到在去除果皮的同时却丢弃了苹果最有营养价值的部分。而且，黄酮化合物是广泛存在于水果和蔬菜中的一类次生代谢类物质,近来研究发现,它们具有很强的清除自由基能力,是苹果中的重要抗氧化物质来源。苹果果实中含有丰富的黄酮类物质,且主要集中在果皮部分,果肉和果心中的黄酮含量远远小于果皮，苹果皮中的总多酚含量达 307mg/100g，
5、总黄酮为 184mg/100g，原花青素为105mg/100g，这些数据是果肉所望尘莫及的。所以在本次实验中我们挑选皮果皮来做实验原料。若存在一种科学有效的提取方法将苹果皮中的总黄酮等抗氧化物质提取分离，加以充分利用，为食品加工业、化妆品工业以及医药业提供天然抗氧化剂资源，将为苹果的加工业开辟新的出路。目前提取分离苹果中黄酮类物质还没有一个完善的方法，本研究旨在找到一个苹果果皮中总黄酮提取的最佳方法，为苹果的营养鉴定提供一个确切的黄酮含量测定标准，并为苹果的开发利用提供一个科学有效的理论依据。3 实验原理3.1 结构黄酮类化合物(Flavonoids)，又称物黄酮(Bioflavonoids)
6、或植物黄酮。黄酮类化合物泛指拥有 15 个碳原子的多元酚化合物，其中两个芳环(A 环、B 环)之间以一个三碳链相连，其骨架可用 C6-C3-C6 表示1。基本结构如图 1-1。 A B 图 1-1 黄酮（A）和异黄酮（B）的分子结构 根据中央三碳链的氧化程度、B 环连接的位置（2-位或 3-位）以及三碳链是否构成环等特点，可将黄酮类化合物进行不同分类。 3.2 性质 游离的黄酮类化合物一般难溶或不溶于水，可溶于乙醇、乙酸乙脂、甲醇、乙醚等有机溶剂或稀碱中。其中黄酮醇、黄酮、查耳酮等，因为分子中存在交叉共扼体系，所以是一类平面型化合物，平面型分子堆砌得比较紧密，分子间引力较大，故很难溶于水。 黄
7、酮类化合物分子中有多个酚羟基，显酸性，可溶于乙醇.碱水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。3.3 分光光度当一束强度为 I0 的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至 I,则溶液的透光率 T 为: 根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律: A=abc 式中 A 为吸光度，b 为溶液层厚度（cm） ，c 为溶液的浓度（g/dm3)， a 为吸光系数。其中吸光系数 与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。 由上式可知，当固定溶液层厚度 l 和吸光系数 时，吸光度 A 与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时
8、，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱） ，从中确定最大吸收波长 ，然后以此波长 的光为光源，测定一系列已知浓度 c 溶液的吸光度 A，作出Ac 工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度 A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。3.4 显色反应在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成螯和物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色，在 510nm 波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律，一般以芦丁标准品定量。 先用亚硝酸钠还原黄酮， 然后加入硝酸铝络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成 2羟基查耳酮而显色。显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位，不具有邻
9、位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时不显色4 实验材料实验所用苹果样品为甘肃天水花牛苹果生产基地4.1 仪器仪器 型号 数量分光光度计 JH-722 1水浴锅 HH-2 1气流烘干器 KQ-B 1电热干燥箱 HG202-2 1比色皿 9容量瓶 15移液管 5分析天平 5烧杯 15量筒 5洗耳球 2漏斗 3滤纸 544.2 药品：药品 芦丁标准样品硝酸铝 亚硝酸钠 无水乙醇氢氧化 钠用量 20mg 10g 5g 1L 8g实验中所有的化学试剂均为分析纯。5 实验步骤5.1 溶液配制（1）5%NaNO2 溶液：准确称取 5g NaNO2 放置于烧杯中溶解，移至 100mL 容量瓶中并定容
10、至刻线。（2）10% Al(NO3)3 溶液：准确称取 10g Al(NO3)3 放置于烧杯中溶解，移至 100mL 容量瓶中并定容至刻线。（3）4%NaOH 溶液：准确称取 4gNaOH 放置于烧杯中溶解，移至 100mL 容量瓶中并定容至刻线。（4）55%乙醇： 称取无水乙醇 150g，加入水 122.7g，配制成 55%的乙醇 （5）65%乙醇： 称取无水乙醇 150g，加入水 80.77g，配制成 65%的乙醇（6）75%乙醇： 称取无水乙醇 150g，加入水 80.77g，配制成 75%的乙醇5.2 标准曲线的制作 本研究以芦丁作为苹果总黄酮含量测定的标准品。（1）波长的选择取样品液
11、适量，在 0.5 mL 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在 450550 nm 波长范围测定络合物的吸光度,并找出最大吸收波长。（2）准确称取芦丁标准品 20mg，用 95%的乙醇溶解，定容到 100mL 的容量瓶中，再精确从中量取 25mL 至 50mL 的容量瓶中，用 95%的乙醇稀释定容，得到浓度为 100g/mL 的芦丁标准溶液。准确吸取该溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0mL，分别置于 25mL 试管中，加入 5%的NaNO2溶液 0.5mL，混匀后放置 6min，然后加入 0.5mL 的 10%的 Al(NO3) 溶液，摇匀后放置6mi
12、n。最后加入 4%的 NaOH 溶液 4mL，用 95%乙醇定容至 25mL, 摇匀，放置 1520min，以上述 8 种溶液为标准品溶液，在 510nm 测定不同浓度的标准品的吸光值。5.3 条件实验（1）温度对总黄酮提取的影响：设定温度为：55 、 65 、 75乙醇浓度为：65% ； 提取时间为：2h（2）乙醇浓度对总黄酮提取的影响：设定乙醇浓度为：55% 、 65% 、 75%温度为： 65 ； 提取时间为：2h（3）提取时间对总黄酮提取的影响：设定提取时间为：1h 、 2h 、 3h温度为：65 ； 乙醇浓度为：65%（4）pH 对总黄酮提取的影响：设定 pH 为 8、9、10、11
13、温度为 65、乙醇浓度 65%、时间 2h取出样品进行过滤，过滤完后，再进行一次过滤，收集滤液试管中，移取 2.5ml 于50ml 的容量瓶中并定容至 50ml,摇匀，用移液管移取 5mL 于试管中，加入 5%的 NaNO2溶液0.5ml，混匀后放置 4-6min，然后加入 0.5mL 的 10%的 Al(NO3) 溶液，摇匀后放置 4-6min。最后加入 4%的 NaOH 溶液 4mL，摇匀，放置 1520min，测其吸光度。按上述标准的显色方法测定总黄酮含量，按下式计算总黄酮得率。总黄酮得率%=【量取液浓度（mg/mL）*体积（mL）*稀释倍数】/称去样品干重（g）*10006 实验结果表
14、一：不同波长对吸光度的影响结果波波长 nm446044704480449055005510552055055405550吸光度 A00.10400.11100.11300.11600.1190.12400.11200.10100.09200.087表二：不同波长对吸光度的影响曲线吸 光 度 A00.020.040.060.080.10.120.14460 470 480 490 500 510 520 550 540 550波 长 nm吸光度A 吸 光 度 A表 三：溶液分光光度测量结果表四：芦丁标准曲线的绘制 标准品溶液浓度 ug/ml0 10 20 30 40吸光度 A 0.023 0.1
15、24 0.272 0.342 0.415图表标题00.10.20.30.40.50 10 20 30 40 50芦丁浓度（ug/mL）吸光度 A吸光度 A线性 (吸光度 A)由表一数据，根据标准曲线的制作方法，以浓度（c，ug/ml）为横坐标，吸光值（A722）为横坐标，进行线性回归，得到回归方程：y=0.01002x+0.0348 r2= 0.9898表 五：温度对黄酮提取量的影响（乙醇浓度设为 65% 2h）温度 55 65 75黄酮含量% 0.637 1.272 1.166乙 醇 浓 度 65% 时 间 2h00.20.40.60.811.21.40 10 20 30 40 50 60
16、70 80温 度 黄酮含量%黄 酮 含 量 %表 六：乙醇浓度对黄酮提取量的影响（温度设为 65 时间 h）乙醇浓度% 55% 65% 75%黄酮含量% 0.846 1.272 0.833温 度 65 时 间 2h00.20.40.60.811.21.40% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%乙 醇 浓 度 %黄酮含量 黄 酮 含 量 %表 七：提取时间对黄酮提取量的影响（温度设为 65 乙醇浓度 65%）时间 h 1 2 3黄酮含量% 0.933 1.272 0.999乙 醇 浓 度 65% 温 度 6500.20.40.60.811.21.40 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5时 间 h黄酮含量%黄 酮 含 量 %
