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1、益气解毒方抑瘤作用及生物信息分析 杨晓慧 吴建春 骆莹滨 方志红 李雁 上海中医药大学附属上海市中医医院 摘 要： 【目的】探讨益气解毒方对肺癌 Lewis 细胞小鼠移植瘤的抑制作用及其可能的机制。【方法】体内实验:复制 Lewis 细胞小鼠移植瘤模型;将 20 只造模小鼠分为模型组, 中药低、高剂量组, 顺铂组, 每组 5 只;给药结束后, 观察各组小鼠一般状况、体质量、去瘤体质量、瘤体质量、肿瘤指数、肿瘤体积及抑瘤率的变化。体外实验:采用 CCK8 法观察益气解毒方对 A549 和 H1299 细胞株增殖的抑制情况, 采用流式细胞术观察益气解毒方对 A549 和 H1299 细胞株的促凋亡
2、作用。生物信息分析:采用生物信息挖掘的方法探索其可能的作用途径、信号通路和作用靶点。【结果】与模型组比较, 中药高剂量组、顺铂组对移植瘤的生长均具有明显的抑制作用 (P0.05) , 但均较给药前增加;顺铂组给药后大鼠体质量较模型组显著减轻 (P0.001) 。中药高剂量组大鼠去瘤体质量较模型组增加 (P0.001) , 顺铂组大鼠去瘤体质量较模型组减轻 (P0.001) 。中药高剂量组、顺铂组瘤体质量均较模型组减轻 (P0.05 或 P0.001) 。中药低、高剂量组和顺铂组抑瘤率分别为 13.94%、30.75%、90.04%。肿瘤指数方面, 中药低、高剂量组与顺铂组较模型组均显著降低,
3、差异有统计学意义 (P0.05 或 P0.001) 。图 2 结果显示:顺铂组肿瘤体积增长缓慢, 其余 3 组在给药 2 周后均增长迅速, 其中中药低、高剂量组较模型组增长稍缓慢, 高剂量组较低剂量组增长稍缓慢。2.3 益气解毒方对 A549 和 H1299 细胞增殖能力的影响图 3 结果显示:在浓度为 0.5、1、1.5、2、2.5 mg/m L 的益气解毒方作用下, A549 和 H1299 细胞株存活率较对照组均显著下降 (P0.05 或 P0.001) 。表明益气解毒方对 A549 和 H1299 细胞株均有明显的抑制增殖作用, 随着药物浓度的增大, 抑制作用逐渐增强;其中, 对 A5
4、49 细胞株的抑制作用较 H1299 细胞株明显。A549 和 H1299 细胞株的半数抑制率 (IC 50) 值分别为 3.063 mg/m L 和6.043mg/m L。表 1 各组荷瘤小鼠相关抑瘤指标的比较 Table 1 Comparison of relevant anti-tumor indexes of tumor-bearing mice in various groups 下载原表 图 2 各组小鼠肿瘤体积增长情况 (N=5) Figure 2 Comparison of tumor volume growth of tumor-bearing mice in various
5、 groups (N=5) 下载原图图 3 益气解毒方对 A549 和 H1299 细胞增殖能力的影响 (N=4) Figure 3 Effect of Yiqi Jiedu Recipe on the proliferation of A549 and H1299 cells (N=4) 下载原图(1) P0.05, (2) P0.001, 与对照组 (益气解毒方浓度为 0 mg/m L) 比较2.4 益气解毒方对 A549 和 H1299 肺癌细胞株凋亡的影响采用 Annexin V/PI 双染流式细胞术检测 A549 和 H1299 细胞株在益气解毒方 1 mg/m L、2 mg/m L
6、 浓度作用 24 h 后的凋亡 (见图 4) , 并对 3 次独立的流式凋亡结果进行统计分析 (见图 5) 。结果显示:益气解毒方可促进 A549 和 H1299细胞株的凋亡, 与对照组比较, 差异均有统计学意义 (P0.05 或 P0.01 或P0.001) ;其促凋亡作用随着药物浓度的加大而增加, 在浓度为 2 mg/m L 时, A549 细胞株的凋亡率达 26.8%, H1299 细胞株的凋亡率达 16.4%, 对 A549 细胞株的促凋亡作用明显优于 H1299 细胞株;凋亡分类中, 晚期凋亡占较大比例。单因素方差分析结果显示, 除 H1299 细胞株早期凋亡中 1 mg/m L 组
7、与对照组无差异外, 其他组别间比较, 差异均有统计学意义 (P0.05 或 P0.01 或 P0.001) 。2.5 益气解毒方肺癌相关生物信息分析及凋亡相关通路、靶点预测2.5.1 靶基因挖掘通过 BATMAN-TCM 网站找出人参、白屈菜所影响的相关靶基因, 结果显示人参靶基因 1 338 个, 白屈菜靶基因 1 181 个, 二者合并, 复方共作用靶点 1 972 个;从 Gene Cards 数据库获得人类肺癌相关基因, 取评分5 的基因共 1 763 个, 将益气解毒方靶基因与肺癌相关基因交叉, 共取得 516 个靶基因, 其相互作用网络见图 6。2.5.2 生物功能及信号通路富集分
8、析用 cytoscape 软件的 BINGO 插件分析这些基因在生物过程中的富集情况。当P0.01 时, 如图 7 显示, 共富集在调节核酸代谢、基因表达, 调节细胞周期、增殖、死亡及凋亡, 组织细胞发育, 刺激应答和物质代谢 5 个方面。缩小富集范围, 取 P1E-30, 显示主要富集在调节生物过程、刺激应答和调节细胞程序性死亡、凋亡等方面, 见图 8。网络图中颜色越深表示富集的意义越大, 体积越大表示包含的基因越多。具体富集描述取前 15 个, 涉及基因取前 10 个, 见表 2。图 4 益气解毒方干预的 A549 和 H1299 细胞凋亡流式细胞图 Figure 4 Flow cytom
9、etry results of apoptosis of A549 and H1299 cells after intervention with Yiqi Jiedu Recipe 下载原图图 5 益气解毒方对 A549 和 H1299 细胞凋亡率的影响 Figure 5 Effect of Yiqi Jiedu Recipe on apoptotic rate of A549 和 H1299 cells 下载原图(1) P0.05, (2) P0.01, (3) P0.001, 与对照组 (益气解毒方浓度为 0 mg/m L) 比较; (4) P0.05, (5) P0.01, (6) P
10、0.001, 与益气解毒方 1 mg/m L 组比较图 6 靶基因相互作用网络图 Figure 6 Interaction network of target genes 下载原图将 516 个基因通过 STRING 网站做 KEGG pathway 富集分析, 显示共富集到 183个相关通路 (P0.05) , 去除与肺癌无关的通路, 按 P 值从小到大排序, 取前20 个作图, 见图 9;具体数据列表显示, 见表 3。结果显示, 这些基因主要富集在 PI3K-AKT、Rap1、TNF、HIF1、ras 通路、Apoptosis、MAPK 等信号通路上。与凋亡、侵袭迁移、低氧应激、自噬、细胞
11、周期、血管形成等密切相关, 其中前 10 个基因中大多与凋亡密切相关。2.5.3 凋亡相关靶点及通路分析挑选上述信号通路中与凋亡密切相关, 并且 P 值最小的几个信号通路, 即PI3K-AKT、TNF、Apoptosis、MAPK 4 个通路, 将其涉及的靶基因共 109 个进行网络相互作用分析并作图, 见图 10。图中节点体积越大、颜色越红表明连接度越大, 连线颜色越深越粗表明总评分值越高。分析发现, 存在相互作用的靶基因有 31 个, 主要靶点有 AKT、HSP90、BCL2、CASP9 等, 将这些基因再次进行KEGG 通路富集, 发现主要富集在 PI3K-AKT 上, 其次为 Ras
12、和 MAPK 通路上 (见表 3) , 推测益气解毒方可能通过影响 AKT、HSP90、BCL2、CASP9 靶基因, 调节 PI3K-AKT 信号通路促进细胞凋亡。图 7 靶基因生物功能富集网络图 (P0.01) Figure 7 Enrichment of biological process of target genes (P0.01) 下载原图图 8 靶基因生物功能富集网络图 (P1E-30) Figure 8 Enrichment of biological process of target genes (P1E-30) 下载原图表 2 采用 GO 分析挖掘在生物过程部分靶基因的
13、富集情况 Table 2 Enrichment of biological process of target genes after Go analysis 下载原表 图 9 相关基因 KEGG 信号通路富集情况 Figure 9 Enrichment of KEGG pathway of target genes 下载原图3 讨论肺癌相当于中医古籍中的“肺积”、“息贲”, 并与“略血”、“哮喘”、“痰饮”等疾病范畴相关。医宗必读积聚篇曰:“积之成者, 正气不足, 而后邪气踞之。”正虚邪实贯穿于疾病的始终。导师李雁教授临床治疗肺癌主张扶正与祛邪并用, 依此组成的中药复方临床多取得较好疗效。“
14、肺主气, 以气为用, 以阴为本”, 肺癌之虚, 以气阴两虚最为多见, 治疗亦重视培补气阴, 肺脾兼治10。人参, 性温, 入脾、肺、心、肾经, 补气生津, 健脾益肺, 契合肺癌病机, 亦是肺癌治疗中最常用的益气扶正药物之一;白屈菜, 性凉, 归肺、胃、肝经, 具有止咳、祛痰、平喘和清热解毒、抗肿瘤作用。二者一温一寒, 一补一泻, 同入肺经, 相辅相成。本研究精简导师的临床验方, 选取由人参、白屈菜所组成的益气解毒小复方为研究对象, 验证该方的体内外抑瘤作用, 并探索其可能途径。本研究结果显示:中药组小鼠瘤体质量较模型组减轻 (P0.05 或 P0.001) , 其中中药高剂量组瘤体质量减轻程度
15、更为明显, 抑瘤率为 30.75%, 体现了该方确切的抑瘤作用;同时, 该方在抑制肿瘤质量增长的基础上, 还显著增加了小鼠体质量 (P0.001) , 肿瘤指数亦明显低于与模型组 (P0.05 或 P0.001) ;在精神状态、活动、饮食等一般情况方面也较模型组有所改善, 体现了该方药既可抑瘤又可扶助正气、增强体质、改善生活质量的作用。与顺铂组比较的结果显示, 虽然后者抑瘤作用显著, 但用药期间荷瘤小鼠体质量减轻近半, 极度消瘦, 精神萎靡, 体毛干枯, 整体状态极差。故可考虑将 2 种药物合用, 以期更好地达到抑瘤增效、顾护正气的作用。CCK8 结果进一步在细胞水平上证实了益气解毒方的抑瘤作
16、用, 并显示其具有良好的量效关系;细胞凋亡结果显示该复方有促进肺癌细胞凋亡的作用, 提示该方抑瘤作用的部分途径可通过促进凋亡来实现。综上所述, 益气解毒方可通过促进肺癌细胞凋亡、抑制其增殖, 起到发挥抑瘤的作用。表 3 KEGG 通路富集情况 Table 3 Enrichment of KEGG pathway of target genes 下载原表 图 1 0 凋亡相关靶基因相互作用网络图 Figure 10 Interaction network of apoptosis associated target genes 下载原图对益气解毒方在肺癌相关靶基因生物信息分析的结果显示, 生物过程富集分析主要针对调节核酸代谢, 调节细胞周期、增殖、死亡及凋亡, 组织细胞发育等5 个方面。当缩小 P 值范围, 调节细胞程序性死亡、凋亡等方面仍为其主要富集区。提示调节细胞程序性死亡、凋亡可能是益气解毒方对肺癌疾病调节
