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1、鸡血藤的 HPLC 指纹图谱及模式识别研究 杨冉冉 姬蕾 李二文 代一航 倪媛媛 韩红园 梅雪 林瑞超 邹迪新 北京中医药大学中药学院 中药品质评价北京市重点实验室 内蒙古医科大学药学院 摘 要： 目的 建立鸡血藤 Spatholobus suberectus 的 HPLC 指纹图谱分析方法, 为其质量控制提供依据。方法 采用 ZORBAX SB-C18 柱 (150 mm4.6 mm, 5m) , 以乙腈 (A) -0.2%磷酸水溶液 (B) 为流动相进行梯度洗脱, 体积流量为 1 mL/min, 检测波长 260 nm, 柱温为 30。并运用聚类分析和主成分分析对鸡血藤指纹图谱进行模式识别
2、研究。结果 建立了鸡血藤药材 HPLC 指纹图谱的共有模式, 确定 35 个共有峰, 并根据对照品指认 6 个共有峰。17 批药材的相似度分析结果与聚类分析、主成分分析结果基本一致。结论 HPLC 指纹图谱结合聚类分析、主成分分析可以快速、高效地评价不同产地鸡血藤药材的质量差异。关键词： 鸡血藤; 高效液相色谱; 指纹图谱; 聚类分析; 主成分分析; 作者简介：杨冉冉 (1992) , 女, 在读硕士, 研究方向为中药品质评价研究。Tel:18811792061E-mail:作者简介：林瑞超 (1954) , 博士, 教授, 研究员, 博士生导师, 研究方向为中药品质评价研究。E-mail:作
3、者简介：邹迪新 (1983) , 女, 博士, 讲师, 研究方向为中药药效物质基础及作用机制研究。E-mail:收稿日期：2017-09-04基金：2015 年度中医药行业科研专项中药饮片质量保障系统研究 (一) (201507002) HPLC fingerprint analysis and pattern recognition of Spatholobus suberectusYANG Ran-ran JI Lei LI Er-wen DAI Yi-hang NI Yuan-yuan HAN Hong-yuan MEI Xue LIN Rui-chao ZOU Di-xin Schoo
4、l of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine; Abstract： Objective To establish an HPLC method for the fingerprint analysis of Spatholobus suberectus, so as to provide evidence for the quality control of it.Methods Separation was performed on a ZORBAX SB-C18 column (150 mm 4.6
5、mm, 5 m) and the mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid with gradient elution.The flow rate was 1 m/min and the wavelength was 260 nm.The column temperature was 30 .The cluster analysis (CA) and principal component analysis (PCA) were applied to studying the HPLC fingerprint and chemical
6、 pattern recognition.Results The HPLC fingerprint of S.suberectus has been established with 35 common peaks, and six of common peaks were identified.The values of similarity evaluation mostly agreed with the result of CA and PCA.Conclusion The application of HPLC combined with CA and PCA could quick
7、ly and objectively evaluate the quality of S.suberectus from different regions.Keyword： Spatholobus suberectus Dunn.; HPLC; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis; Received： 2017-09-04鸡血藤是我国常用的活血化瘀中药, 中国药典2015 年版收载其为豆科植物密花豆 Spatholobus suberectus Dunn.的干燥藤茎, 性温, 味苦、甘, 归肝、肾经, 具有活
8、血补血、调经止痛、舒筋活络的功效1。其主要化学成分有黄酮类、香豆素类、三萜类和蒽醌等2。鸡血藤主产于广西、广东, 但市场上所用的鸡血藤品种较为复杂, 除中国药典收载的密花豆外, 还有豆科、五味子科、木通科等共 6 个属 15 种和变种的植物, 如香花崖豆藤、厚果鸡血藤、大血藤等, 它们的有效成分不尽相同, 其主治功效也不同, 因此临床上不可混淆3。为全面控制鸡血藤的质量, 本实验采用高效液相色谱法对 17 批鸡血藤药材和 4批鸡血藤混伪品进行分析, 建立 HPLC 指纹图谱, 确定了 35 个共有峰, 并结合聚类分析和主成分分析 (PCA) 2 种数理统计方法进行模式识别研究。1 材料与试剂1
9、.1 材料鸡血藤药材及其混伪品收集于广东、广西等地, 经北京中医药大学中药学院中药鉴定系刘春生教授鉴定为鸡血藤 Spatholobus suberectus Dunn.、大血藤Sargentodoxa cuneata (Oliv) Rthd et Wils.、山鸡血藤 Millettia dielsiana Harms、白花油麻藤 Mucuna birdwoodiana Tutcher, 见表 1。表 1 鸡血藤及其混伪品 Table 1 Spatholobus suberectus and its counterfeits 下载原表 1.2 仪器与试药Waters 2695 高效液相色谱仪
10、(包括 2695 四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、2489 紫外检测器、Empower 色谱工作站) ;医用数控超声仪 (KQ-250DE 型, 昆山市超声仪器有限公司) ;New Classic MF 电子分析天平 (Mettler Toledo 公司) 。N-1000 型旋转蒸发仪 (上海爱朗仪器有限公司) 。对照品原儿茶酸 (批号 PS001118, 质量分数98.0%) 、儿茶素 (批号 PS1000-0025, 质量分数99.0%) 、表儿茶素 (批号 PS000001, 质量分数99.0%) 、芒柄花素 (批号 PS0215-0025, 质量分数98.0%) 均购自成都
11、普思生物科技有限公司;甘草素 (批号 CHB160309, 质量分数98.0%) 、紫檀素 (批号 CHB160910, 质量分数98.0%) 、山柰酚 (批号 CHB160407, 质量分数98.0%) 均购自成都克洛玛生物科技有限公司;乙腈为色谱纯;磷酸为色谱纯;其他试剂均为分析纯;蒸馏水为广州屈臣氏公司生产。2 方法与结果2.1 液相色谱条件色谱柱为 ZORBAX SB-C18柱 (150 mm4.6mm, 5m) , 流动相为乙腈 (A) 和0.2%磷酸水溶液 (B) ;梯度洗脱 (表 2) , 体积流量为 1 m L/min, 检测波长为260 nm, 柱温为 30, 进样量为 15
12、L。表 2 梯度洗脱程序 Table 2 Gradient elution program 下载原表 2.2 供试品溶液的制备称取不同产地鸡血藤药材粉末 (过 40 目筛) 约 3 g, 精密称定, 置圆底烧瓶中, 加入氯仿-甲醇 (41) 80 m L 加热回流 1.5 h, 滤过, 滤渣再加氯仿-甲醇 (41) 50 m L 加热回流 1 h, 滤过, 合并滤液, 浓缩至干, 甲醇溶解, 转移至5 m L 量瓶中, 摇匀, 0.45m 微孔滤膜滤过, 即可。2.3 精密度试验取同一批 (S7) 鸡血藤样品, 按“2.2”项下的方法制备, “2.1”项色谱条件测定, 连续进样 6 次, 检测
13、指纹图谱, 结果各共有峰相对峰面积的 RSD 为0.27%3.81%, 相对保留时间的 RSD 为 0.01%0.69%, 表明仪器精密度良好。2.4 重复性试验取同一批 (S7) 鸡血藤样品, 按 2.2”项下方法平行制备 6 份供试品溶液, “2.1”项色谱条件测定, 检测指纹图谱, 结果各共有峰相对峰面积的 RSD 为0.73%3.12%, 相对保留时间的 RSD 为 0.01%1.28%, 表明重复方法性较好。2.5 稳定性试验取同一批 (S7) 鸡血藤样品, 按“2.2”项下的方法制备供试品溶液, “2.1”项色谱条件测定, 分别在 0、4、8、14、20、24 h 检测指纹图谱,
14、结果各共有峰相对峰面积的 RSD 为 0.25%3.09%, 相对保留时间的 RSD 为 0.01%2.58%, 表明样品稳定性良好。图 1 鸡血藤 (A) 及其混伪品 (B) 的 HPLC 指纹图谱 Fig.1 HPLC fingerprint chromatograms of Spatholobus suberectus (A) and its counterfeits (B) 下载原图2.6 鸡血藤指纹图谱的建立及共有峰的鉴定分别取鸡血藤药材和混伪品药材, 按“2.2”项下方法制备供试品溶液, “2.1”项色谱条件测定, 共得到 17 批鸡血藤样品和 4 批混伪品的 HPLC 指纹图谱,
15、 见图 1。将其导入至中药色谱特征图谱相似度评价系统软件 (2012 版A) , 设定 S1 为参照图谱, 选取时间窗宽度为 0.2 min, 采用平均数法生成共有模式图, 共确定 35 个共有色谱峰, 见图 2。通过与对照品对照, 指认其中 6个色谱峰, 即 6 号峰为原儿茶酸, 11 号峰为儿茶素, 15 号峰为表儿茶素, 20号峰为甘草素, 27 号峰为山柰酚, 30 号峰为芒柄花素。2.7 共有峰的相对保留时间和相对峰面积在所建立的色谱条件下, 鸡血藤的共有峰有较好的分离, 保留时间较为稳定, 同时 35 个共有峰均能稳定出现, 以 18 号峰为对照峰, 计算其他 34 个共有峰的相对
16、峰面积和相对保留时间, 见表 3、4。图 2 鸡血藤药材 HPLC 指纹图谱共有模式 Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprint chromatogram of S.suberectus 下载原图6-原儿茶酸 11-儿茶素 15-表儿茶素 20-甘草素 27-山柰酚 30-芒柄花素 6-protocatechuic acid 11-catechin 15-epicatechin 20-licorice 27-kaempferol 30-formononetin表 3 17 批样品共有峰的相对峰面积 Table 3 Relative peak areas of common peaks for 17 batches of samples 下载原表 表 3 17 批样品共有峰的相对峰面积 Tabl
