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1、基因工程原理Introduction to genetic engineerins一、基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体 DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。二、基因工程诞生的理论基础1 . DNA 是遗传物质1944 年 Avery，确定了基因的分子载体是 DNA，而不是蛋白质。1952 年 Alfred Hershy 和 Marsha Chase 进一步证明遗传物质是 DNA。2. DNA 双螺旋结构1953 年 James D. Watson 和 Francis H. C.
2、 Crick 揭示了 DNA 分子的双螺旋结构和半保留复制机制。3、中心法则与遗传密码1957 年 Crick 又提出了遗传信息传递的“中心法则” 1964 年 Marshall Nirenberg 和 Gobind Khorana 等终于破译了 64 个遗传密码在遗传学上，把遗传信息的流动方向叫做信息流。信息流的方向可以用科学家克里克提出的“中心法则”来表示。从“中心法则”可以看出，遗传信息的一般流动方向（图中红线所示）是：遗传信息可以从 DNA 流向 DNA，即完成 DNA 的自我复制过程，也可以从 DNA流向 RNA，进而流向蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译过程 受体细胞经过一些特殊方
3、法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 三、基因工程诞生的技术突破1. 限制性内切酶（restriction enzymes）1970 年 H.O. Smith 等分离出第一种限制性核酸内切酶。2. DNA 连接酶（ligase）1967 年 5 个实验室几乎同时发现了 DNA 连接酶。3. 载体（vector）1972 年前后使用小分子量的细菌质粒和 噬菌体作
4、载体。在细菌细胞里的大量扩增。4. 感受态体系1970 年 M. Mandel 和 A. Higa 发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972 年 S. Cohen 发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒 DNA。5. 琼脂糖凝胶电泳1960s 发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的 DNA 分离开。6. DNA 测序技术1975 年 F. Sanger、A. Maxam 和 W. Gilbert 发明了 DNA 快速测序技术。四、基因工程的特征1. 跨物种性外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。2. 无性扩增外源 DNA 在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。五、基因工程的主要
5、操作内容1. 目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或 PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA 片断。2. 重组体的制备将目的基因的 DNA 片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。3.重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因） 。5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。第一节 分子生物学实验室常用设备温度控制系统 冰箱：4 0C、-20 0C、-70 0C 恒温培养箱：隔水式、电热式 鼓风干燥箱 恒温水浴 低温循环水浴 微量加热器 恒温空气摇床 PCR 热循环仪 制
6、冰机 冷库 高压蒸汽灭菌器电泳设备 琼脂糖凝胶电泳系统 垂直板凝胶电泳系统 转移电泳系统 紫外分析仪 凝胶成像系统离心设备 台式高速冷冻离心机 高速冷冻离心机 大容量离心机 超速离心机分光光度计722S、7200 可见分光光度计紫外可见分光光度计其它 PH 计 电子天平 旋涡振荡器 磁力搅拌器 超声波破碎仪 超净工作台 纯水器第一章 基因工程的主要技术原理第一节 DNA 的提取与纯化由于提取 DNA 的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA 的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。一、质粒 DNA 的提取（一） 、质粒载体概念 细菌质粒是独立于宿主基因组复制、编码抗生素抗性
7、基因的小型环状 DNA 分子、运载克隆 DNA 的常用载体。质粒特点：染色体外的小型环状分子，大小约为 2200kb，通常以多拷贝(可多达几百个)形式存在于宿主细胞中。质粒含有复制起点( ori)用以保证质粒的自主复制正常复制依赖宿主细胞中的聚合酶及其他成分。质粒一般仅携有几个基因抗生素物质的抗性基因。最常见的抗性基因是 amp+基因，编码可以降解青霉素类抗生素如氨苄青霉素的 内酰胺酶。另一种常见抗性基因是 tetA 基因，编码一种可以从细胞内将四环素类抗生素排出的跨膜蛋白。pMD-18 T Vector pGEMT(二)、质粒 DNA 的制备小量法：碱裂解法（11 分 30 秒）大量法：Cs
8、Cl 密度梯度离心法（1 分 30 秒）试剂盒：由于质粒远远小于大肠杆菌染色体 DNA，可以用物理化学方法将它们相分离，例如碱裂解法。1 .碱抽提法提取质粒 DNA（1）原理 闭合环状的质粒 DNA，在变性后不会分离，复性快；（2） 所用的试剂作用 溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1，4 糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械力（震荡）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制 DNA 酶的活性，防止 DNA 被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供 pH12 的碱性条件，使 DNA 双链变性。
9、SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括 DNA 酶）变性沉淀。 NaAc-HAc 缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的 pH 调到 4.8。 用来中和 NaOH 变性液，使 DNA 复性。高浓度的 NaAc 有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA 等）沉淀。 乙醇用于沉淀 DNA。DNA 分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去 DNA 分子的水环境。 RNase A降解 RNA 渣滓。 以免提取后的 DNA 中含有小分子的 RNA。 TE 缓冲液DNA 保存液。 由 Tris-HCl 和 EDTA 配制。 Tris-HCl 不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或
10、硼酸缓冲业） ，有利于以后操作； EDTA 抑制 DNA 酶，防止 DNA 被酶降解。 酚-氯仿蛋白变性剂，进一步抽提 DNA 溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在 DNA 溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化 DNA)。（3）碱抽提法提取质粒 DNA 的步骤 第一步：溶菌使用“溶液”溶解细菌细胞壁。Solution I 的配制：50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml 溶菌酶， RNase A第二步：破膜，蛋白质和 DNA 变性溶液 II 破坏细胞膜，蛋白质和 DNA 变性。Solution II 的配制：0.2N
11、NaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液 III 使 DNA 复性、并促使蛋白质-SDS 复合物和染色体 DNA、RNA 沉淀。Solution III 的配制：3M 醋酸钠（用冰醋酸调 pH 至 4.8）第四步：离心除去沉淀上清液中含有闭合质粒 DNA。第五步：纯化 DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀 DNA0.6 倍体积的异丙醇或 2 倍体积的乙醇。. 小量法：碱裂解法（11 分 30 秒）携有目的质粒的大肠杆菌菌株数毫升液体培养基（LB）增殖至稳定期(过夜培养)离心 菌体沉淀小量制备法提取质粒. 氯化铯梯度（1 分 30 秒） 制备大量的质粒可作为常用克隆载体贮备，或用作大量酶
12、解反应的底物。此时 CsCl 密度梯度离心可被用来作为最终纯化步骤。该步骤虽然有点费力，但却是获得极纯的超螺旋质粒 DNA 的最佳方法。. 试剂盒（11 分 30 秒）QIAGEN 等试剂盒 .一步法提取质粒 DNA（16 分 20 秒）2. 影响质粒 DNA 产量的因素最重要的是：菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。（1）受体菌株一般要使用 endA 基因发生突变的大肠杆菌菌株。如 DH5、JM109、XL1-Blue 等。endA 基因编码核酸内切酶，在 Mg2+的存在下可将双链 DNA 消化成 7bp 的寡核苷酸片断。（2）质粒拷贝数这是直接决定 DNA 产量的重要因素之一。质粒本身的性质
13、所决定。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。二、基因组或其他 DNA 的提取1.细菌基因组 DNA 的制备一般过程及原理（1）细胞裂解10%SDS 和蛋白酶 K。37 oC 温育。不用 NaOH !（2）DNA 纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。（3）沉淀 DNA0.6 倍体积的异丙醇。2. 哺乳动物细胞基因组 DNA 的抽提一般过程及原理：（1）组织粉碎动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（2）细胞裂解0.5%SDS 和 0.1mg/ml 蛋白酶 K。50 oC 温育。SDS 是离子型去垢剂（det
14、ergent） ，可以使细胞膜崩解。（3）纯化 DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀 DNA用 2 倍体积的无水乙醇（可以加入 1/10 体积的 3M 醋酸氨辅助沉淀）（5）除去 RNA 污染用 RNase。三、DNA 的定量和纯度测定1. 紫外光谱法原理：DNA（或 RNA）在 260nm 波长处有特异的紫外吸收峰。蛋白质在 280nm 处有吸收峰用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。2. 琼脂糖凝胶电泳估计原理：溴化乙锭（EB）能插入 DNA 分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。与已知浓度的 DNA 电泳带荧光强度对比，就可以估计出 DNA 含量。四、DNA 分子
15、量的估计一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的 DNA 标准混合液对比得知。DNA 分子量 Marker 有许多公司的商品，使用非常方便。如 DNA 的 Hind酶切物等。第二节 DNA 的凝胶电泳一、电泳的基本原理1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 4. 摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。5. 如果电场强度一定（电压和电极距离） 、电泳介质相同（电泳液和凝胶）： 分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和
16、形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。相同分子量的 DNA:环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。二 、琼脂糖凝胶电泳1. 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。2. 琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨” 。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度） 。浓度高 空隙小3.琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过； 空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。琼脂糖的浓度（%） 分离 DNA 的片断大小（bp）0.3 0.7 1.4500001000 200001000 6000300三 、聚丙烯酰胺
