细胞活力的测定

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1、http:/ 细胞污染的分析http:/ THP-1indent细胞：皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1 细胞是悬浮的。由于我们实验室养细胞的时间也不是很长，所以也只能说说自己平时的操作了。先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底，也就是细胞与细胞之间没有间隙时，就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液，用 D-Hanks液洗两遍，再 加入 0.25%的胰酶，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后静置两分钟左右，最好是能在显微镜下观察，当细胞之间出现间 隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶，加入含血清培养液，摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止

2、胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使细胞脱 落。再分瓶补加培养液。THP-1细胞的传代就比较简单了。可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好，没有其它杂质即细胞裂解物之类的，就 可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一，将余下的培养液分成两瓶，再分别补加培养液即可。 如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约 600转离心六分钟，细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂 质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵，那就提高转速可以 1000转离心六分钟，这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去

3、除上清液，加入新 的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。目前的方法就这些，希望对新手有所帮助/indentTHP-1 细胞是悬浮细胞，相对贴壁细胞要求高一点。细胞养不好，可能的原因有，THP-1 细胞特别依赖细胞浓度，ATCC 上 10 5到 106每 ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。1、细胞株的来源很重要，如直接来源于 ATCC（American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心）生命力要强于国内细胞库的2、注意细胞的密度一定要高，介于 5105 106/ML之间，增值的快。细胞数量太少，不适合 THP-1生长，一般状态不好的 THP-1在培养了

4、 3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基 严重泛黄，细胞数量会巨增。这一点不同于同是单核细胞系的 U937细胞。3、THP-1 细胞适合在细胞 ph环境偏酸环境生长，对培养基变化非常敏感，所以 尽量使用相同 ph的 1640，4、还要注意，传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般 THP-1 生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后 34 天再观察，一般 4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增。1)THP-1 细胞喜欢酸性条件，你不要 老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好。2） 不要频繁换液，一般 2-3次换

5、液离心一次（只是补充培养基）3） 使用 1640（ATCC 推荐），注意加碳酸氢钠 2.5g就可以了，宁酸勿碱 4） 注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存 5）感觉Hyclone的血清比较好 6）复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 【试剂及配制】（1） 聚蔗糖- 泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为 1.0770.0001。（2） 台盼蓝染液：称取 4g 台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至 100ml，1500r/min 离心15min，吸取上层液，即为 4%水溶液。用前，用 1.8%氯化钠溶液稀释 1 倍，即为 2%台

6、盼蓝染液。（3） HBSS 或 RPMI-1640 液【操作方法】（1 ） 采集静脉血若干 ml(随需要而定), 注入盛有肝素的无菌小瓶中 (每 1ml全血用 0.1ml 125250U/ml 肝素溶液抗凝), 加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝；（2 ） 用吸管加入等体积的室温 HBSS 或 PBS,使血液等倍稀释,可降低红细胞的凝聚, 提高分离效果（此步骤亦可省去）；（3） 吸取淋巴细胞分层液(每 10ml 稀释血加 5ml 分层液) 置于 15ml 或 50ml 离心管中, 然后将离心管倾斜 45角,将稀释血液在距分层液界面上 1cm 处沿试管壁缓慢加至分层液上面 (亦可将吸管嘴插入离心管底

7、部,将分层液缓慢加在稀释血液的下面),应注意保持两者界面清晰, 勿使血液混入分层液内；（4） 将离心管置水平式离心机内,在 1820下,以2，000r/min 离心 20min。离心后 ,管内可分为以下四层: 上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。见图 1。 Ficoll-Hypaque 离心法分离血液成分 （5 ） 用毛细吸管轻轻插入灰白色层, 沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞, 盛入另一支离心管中;或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板, 再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞。既要尽量吸取所有单个核细

8、胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆, 以免混入其他细胞成分；（6） 将所得到的 PBMC 悬液用 5 倍体积的 HBSS 或 RPMI-1640 洗涤 2 次,依次以 2，000r/min、1500r/min 在室温下(18 25)离心 10min,可去掉大部分混杂的血小板；（7） 用完全 RPMI-1640 定容细胞,计数细胞后再调整细胞所需浓度。一般每 ml健康成人血可分离出 1106210 6个单个核细胞；（8） 用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性:取 2 滴细胞悬液加 1 滴 2台盼蓝染液,510min 后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色, 死细胞染成蓝色。计数 200 个细胞,计算活细

9、胞百分率, 一般活性应在 95以上。【注意事项】（1） 与血液样品接触时应注意生物安全防护, 避免血源性传染病。 （2） 操作应轻柔, 细胞悬液应充分混匀,避免损伤细胞活性及细胞丢失。 （3） 细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一,最适密度在室温下应为 1.0770.001g/L;应避光4下保存,取出后逐渐升至室温后混匀, 方可使用; 使用中应避免细菌污染。（4） 稀释血液可降低红细胞的凝聚,提高淋巴细胞收获量, 但如果要保留血浆成分作其它实验用时 ,则不能稀释血液 ,以免影响血浆成分。（5） 离心时的温度对分离效果亦有影响,温度过低,离心时间需适当延长,淋巴细胞丢失增多;温度过高, 增加

10、红细胞凝聚,且影响淋巴细胞活性. 离心时最适温度为 1820 。（6） 若从未抗凝血中分离单个核细胞,可先用链激酶溶解血凝块, 然后再按上述方法分离。（7） 分离组织中的单个核细胞亦可采用上述方法。高密度淋巴细胞分离液的配制及其应用市售淋巴细胞分离液密度为 1.0770.002 g/m1,适于人外周血淋巴细胞的分离。小鼠脾淋巴细胞的分离应使用密度为 1.088 g/m1的淋巴细胞分离液。国外已有该分离液出售,但目前国内尚无供应。我们用聚蔗糖(Ficoll 400)和泛影葡胺(Hypaque)将市售淋巴细胞分离液的密度调至 1.C89g/ml,用于小鼠脾淋巴细胞分离,取得了满意的效果。 材料和方

11、法 淋巴细胞分离液(P=l,哪 9 g/m1)的配制 量取 40Ficoll 400 溶液(上海试剂二厂)72 m1,泛影葡胺注射液(北京第三制药厂)25.3 ml,双蒸水 72.7 ml,混匀后加入密度1.077g/m1的淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)340 m1,再混匀。司 P20用比重天平测其密度;用冰点渗透压计测定渗透压两次,取平均值。抽滤除菌后分装,每瓶 6 ml,低温保存。 小鼠脾淋巴细胞的分离雄性 BALB/e小鼠,1620 周龄,体重 1418 g,摘除眼球放. 阅读(103) 评论 (0) 酸性 -醋酸萘酯酶染色法-转载一、原理 T 淋巴细胞质内含有酯酶，可以水解 -醋酸萘酯

12、，产生 -萘酚，-萘酚又可与重氮付品红偶联生成不溶性的偶氮付品红萘酚，在 T淋巴细胞浆酯酶存在的部位生成不溶性的黑红色的颗粒沉淀，而 B 淋巴细胞无此反应。以资鉴别。 二、材料与试剂 1固定液 40%甲醛 (可用 2.5%戊二醛代替)2分层液（聚蔗糖泛影葡胺） 比重 1.077+0.001，配制见细胞分离技术一章。 聚蔗糖泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名 Ficoll,分子量 400 000,多配制成 401%(W/V)水溶液,也有干粉出售. 应用时,用蒸馏水配制 9%溶液.泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名 Vrograf

13、in,结构式为 3,5二乙酰氨基 2,4,6 三碘苯甲酸 1去氧甲氨基山梨醇.含量为 60%或 75%,每安瓶为 20ml 装,常用于人的脏器造影.应用时, 取 60%泛影葡胺原液 20ml,加双蒸馏水 15.38ml,即为 33.9%泛影葡胺. 1.0770.001 聚蔗糖泛影葡胺的配制: 9%聚蔗糖液 24 份 33.9%泛影葡胺液 10 份混合即可.必要时, 可测比重.需要备用, 可用 G5 漏斗过滤除菌或 114.3高压灭菌 15min,4保存.一般可保存 3 个月. 如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算: 式中 dm 为分层液的比重,d1 和 d2 分别为 9%聚蔗糖和 33.

14、9%泛影葡胺的比重,V1 和 V2 分别为它们的体积.如需配制 1.077 比重的聚蔗糖泛影葡胺的分层液,则 9%的聚蔗糖和 33.9%的泛影葡胺的比例应为 10046.3. 3染色液 （1）副品红液：取 2g 副品红加入 2N HCl 100ml, 温水浴溶解后保存于 4备用。 （2）亚硝酸钠溶液（现用现配）：取 0.14g 亚硝酸钠加入双蒸馏水 10 ml，振荡溶解。 （3）-醋酸萘酯溶液：取 2g-醋酸萘酯溶于乙二醇单甲醚（可用丙酮代替）100ml 中，贮于棕色瓶内，于 4保存。 （4）0.067 Mol/L pH7.6PB 液 甲液 KH2PO4 9.08 溶于 1 000ml 双蒸馏

15、水 乙液 KH2PO4 9.47g 溶于 1 000ml 双蒸馏水 （6）甲基绿复染液：取 1g 甲基绿，溶于 100ml 双馏水中，4 保存。 （7）应用染色液（孵育液）的配制 取 1ml 亚硝酸钠溶液缓慢滴入 1ml 的付品红液中，边加边摇匀，付品红液由红色变为浅黄色，混合后，静置 1min2min，将此混合液倒入 30ml pH7.6PB 液中，充分混合后，再加入 -醋酸萘酯溶液 0.85ml，边加边搅拌，混匀后使用。 三、操作方法 1标本的制备 取肝素抗凝血 1ml，加等量或适量的生理盐水稀释，取分层液 2ml 加入离心管内，然后将上述稀释的血液沿管壁缓缓加入至分层液上，注意不要打破两层界面。以水平转子离心机 1 0001 500r/min 离心 20min。结果形成四层，最上面第一层为血浆层，第二层为淋巴细胞（包括单核细胞）层，第三层为分层液，第四层为红血球。用毛细管吸取血浆层，然后吸取淋巴细胞放入适量的 Hanks 液（或生理盐水）中，充分摇匀。2 000r/min 离心 5min10min 弃上清液，再重复洗涤一次，即获淋巴细胞。以此淋巴细胞粥涂片。自然干燥后，以 40%甲醛蒸汽固定 10min。 2染色镜检 （1）于固定的标本