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1、对于细胞冻存技术的了解与设想与细胞冻存有关的文献着实不少，对象从不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响到冻存人脐血间充质干细胞向类肝细胞的诱导分化，从对于相关技术的研究二甲基亚矾与甘油两种冻存保护液对细胞保护作用的比较到实践探索冻存复苏条件对髓性白血病细胞株生物学特性的影响内皮生长晕细胞冻存和复苏的可行性，以及最终的探索肿瘤细胞冻存方法的探讨杂交瘤细胞冻存和复苏的新方法冻结保存对黏附细胞超微结构的影响。丰富的知识让我了解到这本来仅出现在影片中的情节其实也可以发生在现实生活中，敢想就可能成功！课上老师讲了关于脐带血冻存的问题，肝脏疾病是临床常见病,发展为终末期肝病之后,传统治疗的疗效往
2、往有限,死亡率高。近年来,正在研究的肝细胞移植和生物型人工肝是全新的治疗技术,但这两种疗法仍然需要解决供肝细胞来源的问题。脐血中含有间充质干细胞,具有多向分化潜能。研究发现,间充质干细胞具有多向分化潜能,可以向肝细胞分化,脐血中含有具多向分化潜能的间充质干细胞,能在体外自我增殖,并可以定向分化为内、中、外 3 个胚层来源的多种细胞,如骨、软骨、脂肪、神经及类肝细胞等,有望用于肝脏疾病的治疗。不过脐血中的间充质干细胞含量很少,如何分离纯化?如何使其较长时间保持干细胞特性?如何诱导其向肝细胞分化?人脐血间充质干细胞能够贴壁生长,而体外培养的贴壁细胞是一个异质细胞群,可能含有多种细胞成分。一般呈现类
3、纤维细胞形态,并可分裂增生,且同时具有间皮细胞标志的贴壁细胞,如 CD44 细胞,可以初步判断为是间充质干细胞。采用将密度梯度离心法与直接贴壁法相结合的方式，首先对脐带血进行密度梯度离心,得到纯度较高的单个核细胞;待其贴壁生长后,通过反复换液除去悬浮生长细胞,当细胞集落的细胞达 80%90%融合时进行传代。随着逐代培养,人脐血间充质干细胞更为纯化。而且以 1108L-1 的密度进行接种传代,细胞的增殖速度优于 1107L-1 的接种密度。实验结果表明,将脐带血分离出的单个核细胞经贴壁生长,并传代纯化后,能获得均一生长的长梭形或多角形贴壁细胞,通过流式细胞仪鉴定,表明这些细胞 97.9%表达 C
4、D44,可以初步判断为间充质干细胞。不过每份脐血中的干细胞收集量毕竟有限,为了满足研究及临床应用的需要,还必须解决其保存的问题。目前长期库存脐血造血细胞的唯一有效办法是加入细胞保护剂后深低温冻存,有报道大鼠骨髓间充质干细胞在液氮中冻存了 6个月以后,细胞的形态及生长状况与冻存前比较,无明显差别。Lee 等将冻存了 0.51 年的 47 份脐血和40 份骨髓单个核细胞进行分离扩增培养,发现 6 代以前的脐血间充质干细胞增殖能力大于骨髓来源的间充质干细胞。本实验以 1109L-1 的细胞密度进行冻存,用低浓度(10%)的二甲基亚砜作为冻存保护液,采用逐级降温的梯度冷冻法,将第 6 代人脐血间充质干
5、细胞冻存于液氮中 6 个月。复苏以后发现,细胞的复苏率达 60%70%,细胞的形态及生长特性没有明显变化,仍然为梭形的细胞,贴壁生长,能形成细胞克隆,增殖传代;且复苏后接种的细胞密度较高(1108L-1),细胞的生长状态更好。实验初步表明,人脐血间充质干细胞能通过冻存的方法长期保存。要利用人脐血间充质干细胞解决肝细胞来源的问题,还必须成功诱导成体干细胞分化为肝系细胞。目前越来越多的研究表明,肝细胞生长因子能诱导间充质干细胞向肝系细胞骨髓基质干细胞也称骨髓间充质干细胞，具有多向分化潜能，是细胞工程学和组织工程学重要的种子细胞。骨髓基质干细胞在骨髓中含量很低，并随着年龄的增大而减少。骨髓基质干细胞
6、过度传代会损害其功能，表现为明显的衰老或凋亡的征兆。而且骨髓基质干细胞在体外长期培养易发生自发分化，而失去其多分化潜能。所以冻存是骨髓基质干细胞研究和应用的重要环节，可以避免骨髓基质干细胞频繁分离纯化的麻烦。骨髓基质干细胞来源于中胚层，具有向中胚层组织及神经外胚层组织分化的能力。基因和超微结构表明具有强大的可逆性。骨髓基质干细胞固有的优势和特性，使其成为医学组织工程理想的种子细胞。骨髓基质干细胞在骨髓中的含量很低，需进行体外分离纯化和大量增殖。但骨髓基质干细胞在体外长期培养易发生自发分化，而失去其多分化的潜能。而且容易产生细胞衰老和凋亡及易被其他细胞系交叉污染和被微生物污染，以及产生基因型的漂
7、变，冻存细胞还可以节省时间和材料。因此及时进行细胞冻存是非常必需的。诱导该骨髓基质干细胞向成骨细胞和软骨细胞分化，表明该分离的细胞确为骨髓基质干细胞。细胞冻存能否获得较好的效果及较高的成活率，受到多种因素的影响，如细胞种类、活力、代数、生长状态、冻存浓度、保护剂、冻存温度和时间、降复温速率、离子浓度等诸多因素的影响。冷冻对各种细胞均能引起破坏作用。细胞在冻存过程中经历包括液体溶液的固化过程和水分子通过细胞膜的渗透过程，在此过程中的溶液冰晶形成、生长，高渗透压损害和防冻剂细胞毒性都会对细胞造成损伤。细胞冻存的这种破坏是由于细胞内形成冰晶以致促使电解质浓度升高引起细胞脱水皱缩致使细胞失活。这与致冷
8、温度、降温率及复温率有关。降温速率过快，细胞内外同时形成冰晶，导致细胞损伤和死亡。而复温速率过慢，也会使细胞内形成冰晶，导致细胞损伤和死亡。因此，冻存条件不同，其杀伤力也不同。保存骨髓基质干细胞时，可能由于在该温度时，二甲基亚砜对细胞有较大的毒性，导致存活时间较短。在溶液的过冷点附近，也易造成细胞的损伤。导致细胞存活时间较短。因此不宜于下保存骨髓基质干细胞细胞。可短期保存，但如果保存时间过长，会引起逐渐降解，而导致存活率逐渐降低。因此，不宜于长期保存。在低温条件下，加入二甲基亚砜作为保护剂，不但没有杀伤力，反而可以利用超低温使细胞处于休止期，长期保存。二甲基亚砜溶液的低共熔点为-41，在该温度
9、时，对细胞杀伤力最大，通过低共熔点后，降低温度不论快慢对细胞存活率影响不大，在低共熔点之前降温过快或过慢，均会影响细胞存活率。传统的细胞冻存有程序性降温液氮冻存法和非程序性降温液氮冻存法。程序性降温液氮冻存法是行之有效的标准冻存方法，温度控制好，对细胞损伤小，有条件的实验室应首选该法。但其步骤复杂费时，需购置专用仪器，成本费用昂贵，难以普及。目前仍存在许多问题,如最佳的分离冻存条件,肝系分化诱导因子的选择及诱导浓度,规范统一的诱导条件等,都还有待更多的实验进一步研究;而已分化的类肝细胞促使未分化细胞向肝细胞定向分化的能力及机制,也还需更进一步的实验证明，但我相信，这些医学难题都会在我们手中得以解决。除人类之病痛，筑幸福之完美的愿望，永远不变！
