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1、DNA分子标记技术在物种鉴定和系 统分析中的应用刘派(北京科技大学化学与生物工程学院生物技术系，北京市 100083)摘要：随机扩增多态 DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)，是美国学者 Williams 和 Welsh 于 1990年首先提出的该技术是通过分析 DNA 的 PCR 产物的多态性来推测生物体内基因排布与外在性状表现的规律的技术。RAPD 技术是以 8-lObp 的随机寡核苷酸片段作为引物，对基因组进行 PCR 扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或 PAGE电泳检测后显色，分析扩增产物 DNA 片段的多态性，此即反应了基因组相应片段由于
2、碱基发生缺失、插入、突变、重排等所引发的 DNA 多态性。至今，该技术已广泛应用于种质资源研究，作物遗传多样性分析，基因定位，找特定基因，如抗性基因、雄性不育恢复基因等可连锁的标记和物种识别，植物系统进化研究等多个领域，本文以草坪草为实验对象进行RAPD 标记技术的应用。关键词：RAPD 分子标记；凝胶电泳；草坪草；随机扩增；DNA引言RAPD 技术一方面继承了 PCR 率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点。此外，与其它 DNA多态性分析方法相比。RAPD 技术还表现出很多独特的优势和特点 :（1）不必知道被测 DNA 特异性位点序列信息；（2）模扳 DNA 的量极少；（3）RAPD
3、技术操作简便快速；（ 4）RAPD 所用引物均为人工定序合成；（5）基因型的检测自动化。本实验在液氮环境下提取六种植物的 DNA 后，用实验室编号为 131-136的引物对六种 DNA 进行随机扩增，接下来对其进行 TBE 凝胶电泳实验操作，得到跑胶结果并对其进行分析。1 RAPD 标记原理1.1 原理技术利用一系列随机引物，以为模板，通过基因放大器进行多态性片段的随机合成如果某一引物与某一片段的模板具有互补的核苷酸顺序该引物就会结合到单链的模板上，在具有种游离的情况下通过聚合酶连接链就会从引物的端开始，某一引物可能会与单链的许多地方结合但只有在个碱基对以内存在反向平行的某一引物互补的双链分子
4、，才可能将合成的新链作为下一次合成的模板这个反应由个不同温度的反应步骤连续循环所组成第一步欲扩增双链的变性双链在加热变成单链，快速冷却阻碍了单链的重新结合第二步，退火，随机寡核苷酸引物互补地靠在模板链的目标位置上退火温度通常在对于理想的技术条件按经验必须优化第三步适温延伸，共进行次循环扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经染色来检测扩增片段的多态性所用的一系列引物其序列各不相同但对于任一特定的引物它同基因组有特定的结合位点如果这些结合位点在基因组某些区域内的分布符合扩增的条件，就可扩增出片段因此如果基因组在这些区域内发生片段插入、缺失、或碱基突变就可能导致这些特定位点分布发生相应的变化
5、而使 PRC 产物增加、缺少或发生分子量的改变因此通过对产物的检测即可测出基因组在这些区域的多态性由于进行分析时可用引物数量很大虽然对每个而言其检测基因组多态性的区域是有限的但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组因此可以对整个基因组进行多态性检测1.2 RAPD 技术的优点技术一方面继承了 PRC 效率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点此外与其它多态性分析方法相比RAPD 技术还表现出很多独特的优势和特点：第一，由于RAPD 技术引物的设计是随机的，因此可在不知道特异性位点序列信息的情况下，对各种生物进行多态性分析构建其基因指纹图谱；第二， 技术需模扳的量极少每个反应仅需
6、几十纳克；第三，技术操作简便快速可免去其它标记中的克隆制备，多态性筛选，同位素标记等步骤；第四，所用引物均为人工定序合成；第五，每个标记就相当于一个序列位点，故这种方法可以使基因型的检测自动化。1.3 影响 RAPD 的因素引物的合成是随机的，但要满足 G+C 的含量不低于 40%，引物的长度以 10bp 为佳，引物太短(9bp)易从模板上脱落，聚合反应难以进行 ;引物的浓度通常是 0.2umol/L，这一浓度足以完成 40 个循环的扩增反应，引物浓度过高可能导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者均可竞争酶、dNTP 和引物。但如引物浓度不足，则 PCR 的效率极低，
7、扩增产物的产量太低。4 种 dNTPs 在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。2 实验步骤2.1 实验材料准备一. 配制 1 M Tris-HCl (pH8.0) 配方:1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)(1). 称量 121.1 g Tris 置于 1 L 烧杯中。(2). 加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。(3). 按下表量加入浓盐酸调节所需要的 pH 值。PH 值 浓 HCl 7.4 约 70ml 7.6 约 60ml 8.0 约 42ml (4). 将溶液定容至 1 L。(5). 高温高压灭菌后，室温保存。二. 配 EDTA
8、（0.5 mol/l pH8.0）配方: EDTA（0.5 mol/l pH8.0）(1)称取 93.06 克 EDTA2Na2H2O，置于 500 mL 烧杯中(2)加入约 400 mL dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌(3)用 NaOH 调节 pH 值到 8，约用 10 克固体NaOH(4)在溶液冷却后，再用 NaOH 调节至 pH=8(5)加 dd H2O 将溶液定容到 500 ml(6)高温高压灭菌后，室温保存三. 1TE Buffer 储存液分装至 500mL 锥形瓶中，250mL/ 瓶，分成 4瓶。灭菌备用。配方组份浓度 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA（pH8
9、.0 ）(1). 量取下列溶液，置于 1L 烧杯中。1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0） 10mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 2mL(2). 向烧杯中加入约 800mL 的去离子水，均匀混合。(3). 将溶液定容至 1L。(4). 高温高压灭菌，室温保存。将三种的溶液配好后，再统一灭菌，保存。四. 准备灭菌水（500 mL 蓝盖瓶装）1 瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口 1.5 mL 离心管 2盒，普通 1.5 mL 离心管 2 盒，普通 4 mL 离心管 2盒，PCR 小指管 200 l 2 盒，灭菌，保存。五. 电泳缓冲液： 5TBE（贮存液/L 室温保存）
10、54 g Tris 碱27.5 g 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）0.5TBE（工作液）2.2 草坪草基因组 DNA 的提取草坪草提前两至三周种植，当草坪草的生长到了比较茂盛的阶段，即可进行基因组 DNA 的提取。使用天根新型植物基因组提取试剂盒(DP320)，操作步骤如下：1. 处理材料：清洗研钵及研磨棒，晾干或烘干，液氮预冷。取草坪草新鲜叶子组织 100 mg 加入液氮充分研磨。加入 400 l 缓冲液 LP1 和 6 l RNase A（10 mg/ml） ，漩涡震荡 1 min，室温放置 10 min。2. 加入 130 l 缓冲液 LP2，充分混匀，漩涡震荡
11、 1 min。3. 12000 rpm（13400 g）离心 5min，将上清移至新的离心管中。4. 加入 1.5 倍体积的缓冲液 LP3（使用前检查是否已加入无水乙醇） ，立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中） ，12000 rpm（13400 g）离心 30 s，倒掉废液，吸附柱CB3 放入收集管中。6. 向吸附柱 CB3 中加入 700 l 漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇） ，12000 rpm（13400 g）离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。注意：如果吸附柱呈现
12、绿色，向吸附柱 CB 中加入 500 l 无水乙醇，12000 rpm（13400 g）离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。7. 重复步骤 68. 将吸附柱 CB3 放回收集管中，12000 rpm（13400 g）离心 2min，倒掉废液。将吸附柱CB3 助于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 （漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验）9. 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 100 l 洗脱缓冲液TE，室温放置 2-5min，12000 rpm（13400 g）离心 2min，将溶液收集到离心管中。10. 将同种植物的
13、 4 份混合至 1 个离心管中，标号，封口处加贴封口膜。放入-20冰箱中长期保存，或者直接进行下一步电泳鉴定。2.3 草坪草基因组 DNA 提取情况的电泳验证对于已经提取完毕的基因组 DNA，需要对其进行 TBE 凝胶电泳实验来验证提取情况。在电泳实验之前需要制作 TBE 胶板，每 100 ml 的药品用量如下：0.7 g Regular Agarose， 100 ml 0.5TBE电泳缓冲液， 7 l GoldView。如需其他用量则按比例添加。1. 称取适量的 Regular Agarose 至锥形瓶中，加入 0.5TBE 电泳缓冲液，在微波炉中加热使之溶解。2. 待稍冷却后加入适量 Go
14、ldView，摇匀。将溶液趁热倒入已经组装好的制胶槽中，待胶板彻底冷却后方可使用。3. 将胶板放入电泳槽中，加入 0.5TBE 电泳缓冲液直至没过胶板。4. 将草坪草基因组 DNA 提取液 10 l 到离心管中并与 1 l Loading Buffer 充分混合后逐个加入到胶板的泳道槽中。在第一个泳道槽内加入规格为 DNA/ Hind的 DNA Marker 5 l。最后一个泳道槽内加入规格为 DNA/ Hind的 DNA Marker 10 l。5. 将电泳槽正负极与电泳仪正负极正确相连，注意电泳方向从负极到正极。设定恒定电压为 110 V，电泳 1 h。6. 取出已经电泳完毕的 TBE 凝
15、胶放入凝胶成像仪（118 室）拍摄图像，记录电泳结果。2.4 基因组 DNA 的定量为方便下一步的 RAPD-PCR 时的加入的样品剂量符合要求，需要将 DNA 浓度稀释到约 100 ng/l，根据 TBE 凝胶电泳的条带明暗程度确定相应稀释倍数。2.5 草坪草 DNA 的 RAPD 扩增1. RAPD 引物的稀释将 RAPD 引物稀释至 10 M/l 。即从 100 M 储备液中吸取 20 l 引物溶液，分别加入180 l 的超纯水，并且标号作为反应用引物。2. RAPD-PCR 反应混合物的制备将以下溶液逐一加入灭过菌的规格为 200 l 的 PCR 专用管中，标号。草坪草基因组 DNA（20ng-100ng/l ）1 l RAPD 引物（ 10 M/l） 1 l 2*PCR Mix 12.5 l 超纯水 10.5 l 总体积 25 l 3. RAPD-PCR 程序94反应 3 min 后开始如下循环：94变性反应 1 min 36退火反应 1 min72延伸反应 2 min 经过以上循环 45 个以
