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1、1分子生物学检测技术简介分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985 年由美国 Cetus 公司人类遗传学研究室 Mullis 等创立并随后迅速发展起来的 DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR） ，以及 90 年代发展起来的 DNA 芯片技术（DNA Chip） ，又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的
2、阶段。一、 核酸分子杂交（一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定 DNA 或 RNA 序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有 Southern 印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交） 、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的 DNA 或 RNA，以及用于检测的 DNA 或 RNA 探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。1、Southern 印迹杂交 是最经典和应用最广泛的杂交方法。 根
3、据基因探针与待测 DNA 限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。2、Northern 印迹杂交 基本原理与 Southern 印迹杂交相同，不同的是它检测 mRNA 而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。由于 mRNA 比 DNA 更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。3、斑点杂交 将待测 DNA 或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解） ，与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室
4、中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。4、分支链 DNA(bDNA)技术 近几年，bDNA 作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于
5、HBV、HCV2和 HIV 等的研究。该方法主要是通过将磷酸化的捕获探针以共价键的形式结合在固相载体上，然后依次加入待测核酸和悬挂有多个支链的信号探针进行杂交，每个支链 DNA 都结合有放大信号的分子(如碱性磷酸酶)，最后通过利用化学发光检测核酸的含量。bDNA 技术是目前核酸直接量化检测技术中灵敏度最高的方法之一。但该方法成本较高，不利于其普及应用。5、原位杂交 直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交反应。该技术可检出细胞中单拷贝 mRNA，估算病毒在宿主细胞中复制和转录的程度，对于病毒感染（特别是具有长潜伏期的病毒感染）和其它退行性疾病的诊断很有用。6、液相杂交 液相杂交酶免疫法量化检测核酸扩
6、增产物 这种方法同固相杂交量化检测核酸扩增产物原理大致相同，只是将反应体系换为液相环境。应用液相杂交量化检测维生素 D 结合蛋白基因，在 PCR 扩增时通过掺入法使产物上挂有地高辛分子，再通过液相杂交与标记有生物素的探针结合后，被包被有链亲和素的酶标微孔板捕获，利用辣根酶标记的地高辛抗体使酶反应底物(OPD 或 TMB)显色。据报道，核酸扩增产物与特异性探针在液相中的杂交效率要高于在酶标微孔板上的结合，液相杂交的灵敏度通常是固相杂交的 1020 倍，可以检测到 pg 水平。二、 聚合酶链反应（PCR）PCR 是近年来发展起来的一种快速的 DNA 片段扩增技术，它通过分别与双链目的 DNA 序列
7、两个 3端互补的寡核苷酸引物，由 Taq DNA 聚合酶从 5到 3进行一系列 DNA 聚合反应，扩增出所需要的目的 DNA。由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶 DNA 的拷贝数几乎呈几何级数增长，因此，20 次 PCR 循环将产生约一百万倍（2 20）的扩增产物。这种 1985 年由 Kary Mullis 建立的方法最早在美国 Cetus 公司人类遗传学研究室应用于人-珠蛋白 DNA 的扩增及镰刀形红细胞贫血病的产前诊断。随后迅速发展起来，将基因诊断提高到一个崭新的阶段。PCR 反应的设计和优化：PCR 技术自建立以来，几年内就成为一项广为应用的研究技
8、术。PCR之所以得到普及主要是因为它灵敏、特异、高效、简便。按照最基本的定义，PCR 只不过是在适宜的缓冲液中将样本 DNA 与寡核苷酸引物、脱氧核苷三磷酸及热稳定的 Taq DNA 聚合酶结合起来，然后反复加热和冷却若干小时，直到获得所需的扩增量。但事实上，PCR 是一个比较复杂、迄今尚未完全明了的生物化学反应。在反应中各种反应成分之间的动态的相互作用决定着产物的质量。尽管在多数情况下，反应的最终结果比较好，但如果要获得更好的结果，就有很多参数需要进一步探讨。由于 PCR 的应用很广泛，因此，不可能有这样一套条件，它在任何情况下都能保证反应地成功进行。但是，一般有一种标准反应，可以适用于大多
9、数的 DNA 扩增反应，即使不能适应，它至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。标准 PCR 的体积通常为 50l 或 100l，除样品3DNA 外，还包括 50mMKCl，10mM Tris-HCl （Ph 8.4，室温） ，1.5mM MgCl2，100g/ml 明胶，0.25M 的各种引物，200M 的各种脱氧核苷酸（dATP，dCTP，dGTP 和 dTTP） ，以及 2.5 单位的TaqDNA 聚合酶。当然，样品 DNA 的类型是可变的，但通常都要具有 102105 拷贝的模板（例如，0.1g 人基因组 DNA） ，通常还要加几滴矿物油，以密封反应，并防止反应体积的减小
10、。利用这些条件可扩增 DNA 的靶序列的范围很大。当上述条件不能产生理想的结果时，即必须进行 PCR 的优化。(一) PCR 缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是 Mg2+ 离子，其浓度对扩增的专一性和扩增量有重大影响。通常最适浓度为 1.5mM 左右（每种 dNTP 的浓度为 200M 时） ，但有时需采用不同的 Mg2+浓度。Mg 2+浓度过高，通常会导致非特异性扩增产物的累积，而浓度过低时通常会降低扩增量。最近证明少用或不用 KCl 和明胶对反应较为有利。四种脱氧核苷酸的浓度通常每种都是50200M。过高的浓度会导致聚合酶将其错误掺入，因此应当避免。浓度为 50M 和 200M 时，足
11、以合成 6.5g 和 25g 的 DNA。由于脱氧核苷酸定量地与 Mg2+结合，因此反应中的 dNTP 的含量将决定游离 Mg2+的含量。在标准反应中，4 种脱氧核苷酸的最终浓度为 0.8mM，因此 原来的 1.5mM MgCl2 中剩下 0.7 mM 未与 dNTP 结合。所以，如果 dNTP 的浓度有很大的改变，MgCl 2 的浓度也必须随着改变。Taq DNA 聚合酶通常浓度为 2.5 单位/100 L 反应液。对于含有序列非常复杂的 DNA 样品（如染色体组 DNA）的扩增反应，Taq DNA 聚合酶的最适浓度通常为 14 单位/100 L。浓度高于此水平时，将导致非特异性 PCR 产
12、物增加。（二）循环参数也是影响 PCR 反应的一个重要因素。标准反应中，将样品快速加热至 9095，使双链 DNA 变性，再快速冷却至 4060，使引物退火结合到互补序列上，然后加热至 7075用TaqDNA 聚合酶延伸退火引物。在 7075下保温时间因被扩增的靶 DNA 长度而异。 （如果靶序列含约 150 个碱基或更短，就可以取消整个延伸过程。聚合酶在较低温度时仍保持很强的活性，延伸过程有退火转变为变性时即可完成） 。过渡时间，即从一种温度转变到另一种温度所需要的时间，取决于所用设备的类型。除了有特殊情况外，这种变温速率并不重要，因而应尽量加快过渡转换，从而缩短实验时间。但是为了确保样品达
13、到所需的温度，应该在扩增过程中测定样品的温度，以确定特定反应中的实际过渡时间。用一根微探针温差电偶和一台数字式万用表即可达到这个目的。变性时温度不够是导致 PCR 反应失败的一个常见原因，但过度变性也是不必要的，应尽可能保持聚合酶活性在整个反应过程中都达到最高水平。退火时的温度取决于引物的长度和 GC 含量。对 GC 含量约 50%，长 20个碱基的典型的寡核苷酸引物来说，通常用 55作为起点温度，尽管较高的温度对提高引物的特异性是必要的，由于在反应的混合物中存在着极其过量的引物，杂交可以在瞬间内完成，因此，不需要长时间退火。有时，引物只有 1215 个碱基，退火温度需达 4045。然而，这样
14、短的引物在 72的延伸温度下不可能保持退火状态。利用聚合酶在较低温度时的部分活性将引物延伸几个碱基，使之稳定，就可以解决这个问题。这可以通过在 5060时进行保温或将温度从 40逐渐升高到 72来实现。简4并引物与靶序列常常会发生多处错误配对，这可以采用类似方法解决。在同一温度下使引物退火和延伸是可能的。在 55以上的温度同时退火和延伸，除了可将反应程序简化为两温度循环外，还可进一步提高反应的专一性。（三）引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。现在对高效而专一性强的引物的选择仍然是凭经验。没有一套规则能确保高效引物对的合成。但是遵循某些原则，则有助于引物的设计。（1） 长度 寡核苷
15、酸引物长度为 1530bp，一般为 2027bp。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T ） ，Ln 值不能大于 38，因为38 时，最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度（74） ，不能保证产物的特异性。（2） G+C 含量 G+C 含量一般为 40%60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下形成 50%寡核苷酸双链的温度，有效启动温度一般高于 Tm 值 510。若按公式 Tm =4 （G+C）+2（A+T）估计引物 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 5580，其 Tm 值最好接近 72以使复性条件最佳。（3） 碱基的随机分布 引物中四种碱基的分布最好
16、是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区引发错误。（4） 引物自身 引物自身之间存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构或引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身不能有连续多于3 个碱基互补。（5） 引物之间 两引物之间不应有互补性，尤应避免 3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应有 4 个连续碱基的同源性或互补性。（6） 引物的 3端 引物的延伸是从 3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构的可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR ）反应中，引物 3端不能发生错配。在标准反应体系中，用 2U Taq DNA 聚合酶和 800mol/L dNTP（四种 dNTP 各 200mol/L） ，以质粒（10 3 拷贝）为模板，按 95
