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1、1胎鼠听囊细胞体外培养研究作者：刘晖，程随涛，许珉，梁建民，马伟军【关键词】 听囊细胞；干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎鼠【Abstract】 AIM: To find the origin of auditory cells in mammals and to study the proliferation and differentiation of auditory cell progenitors. METHODS: Otocyst epithelia surgically isolated from fetal rats were cultured and passaged. Prol
2、iferation and differentiation of cultured cells were observed using BrdU labeling to find the progenitors. Immunocytochemistry (Factin, cytokeratin and calretinin) was used to detect cell properties of cultured cells. RESULTS: Otocyst cells differentiated and proliferated and showed several morphoty
3、pes, mainly including epitheliallike cells, fibroblastlike and neuronlike cells. All of cells were labeled positive to Factin and cytokeratin. A subset of cells were labeled strong positive by calretinin in primary culture. But few passaged cells were positive to calretinin. BrdU labeling showed cul
4、tured cells could proliferate significantly. The morphological phenotype was retained throughout 8 2passages during 4month culture. CONCLUSION: In natural culture condition in vitro, otocyst cells of fetal rats can differentiate or proliferate to immature hair cells. The study will provide some idea
5、s and methods for further research about hair cell regeneration.【Keywords】 otocyst cells; stem cells; cell proliferation; differentiation; fetal rats【摘要】 目的： 了解哺乳动物听觉细胞的来源，探索听觉细胞前体细胞体外增殖和分化. 方法： 取孕鼠胚胎听囊细胞进行体外培养，用免疫细胞化学方法，分别对培养的细胞进行细胞角蛋白、F肌动蛋白和 calretinin 染色观察细胞特征；BrdU 染色观察细胞增殖. 结果：培养的细胞在体外进行分化和增殖，细胞
6、形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态 3 种. 对细胞角蛋白和 F肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色呈阳性. 在原代培养就出现calretinin 染色明显阳性的细胞. 传代后结果仍为阳性着染，但强度减弱. BrdU 染色显示培养细胞具有明显的增殖活性. 本研究共传 8代，历时 4 mo，细胞形态维持稳定. 结论： 胎鼠听囊细胞在体外自然培养条件下可以分化或者增殖为未成熟毛细胞. 本研究为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.3【关键词】 听囊细胞；干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎鼠由噪声、耳毒性药物等引起的耳蜗毛细胞损害而致的感音神经性耳聋是耳鼻咽喉科难治之症. 如
7、果能够建立一种细胞系，而这种细胞系又具有分化为听觉毛细胞的潜能，不但有利于听力学研究，也有利于进行药物的发展及毛细胞生物学方面的研究. 我们对胎鼠听囊细胞用自然培养方法进行体外培养，并应用免疫细胞化学方法，对培养细胞进行了染色标记和观察.1 材料和方法1.1 材料选用怀孕 14 d 成年健康小鼠 1 只，灰色，体质量 0.15 kg. 耳廓反射正常，鼓膜正常. 细胞培养基 DMEM（Gibco 公司） ；100 mL/L 胎牛血清（FBS） （Sigma, USA） ；2.5 g/L 胰酶（Sigma, USA） ；抗 calretinin mAb( 1100 Chemicon 28820 S
8、ingle Oak Drive. Temecula, CA 92590，USA） ；鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（1200） ，抗 F 肌动蛋白单克隆抗体phalloidinFITC（1200）和鼠抗体 Cy3 均购自 Sigma 公司；BrdU 试剂盒（Germany ）.1.2 方法41.2.1 听囊制备引颈法杀死实验孕鼠，取出子宫，置入放有DMEM 培养液的培养皿中. 用两只无菌镊撕开子宫，使胚胎与子宫内膜和胎盘游离，放入有新鲜培养液的培养皿中. 在解剖显微镜下仔细分离听囊，放入准备好的培养液中进行培养. 本次实验共取出胎龄为 14 d 的小鼠胚胎 9 只.1.2.2 听囊细胞培养 14
9、个胚胎听囊上皮组织（ 7 胚）置入 PBS液中清洗 2 次，在显微镜下用小剪刀剪碎组织，放入含有 2.5 g/L胰酶的 PBS 液中 37 消化 8 min，吸液管上下吹打 20 次，然后加入含 100 mL/L 胎牛血清（ FBS）的 DMEM 液中终止消化；细胞悬液经离心后弃上清，加入培养液观察. 培养液包括 DMEM； L 谷氨酰胺，100 mg/L 氨卞青霉素和 100 mL/L 胎牛血清（FBS ）. 细胞悬液加入 24 孔培养板中在 37, 50 mL/L CO2 孵箱中孵育（部分培养孔放置有盖玻片） ，每 34 d 更换培养液 . 相差显微镜下（Nikon，日本）观察.当细胞汇合
10、贴壁，细胞融合达 80%以上时，应用 2.5 g/L 胰酶EDTA 法消化 5 min，进行传代. 将分离的细胞用含 100 mL/L 胎牛血清（FBS）的 DMEM 液进行倍数递增稀释，直至细胞浓度稀释至20103/L，然后进行传代培养.1.2.3 免疫细胞化学染色 抗细胞角蛋白染色 : 载有培养细胞的5盖玻片在 40 g/L 多聚甲醛中（ 0.1 moL/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）固定 30 min，用含 100 mL/L 山羊血清， 1 mL/L Triton X100 的PBS 液阻断 20 min 后，抗细胞角蛋白（cytokeratin）mAb (1200) 进行孵育，4 过
11、夜. DPBS 液洗 3 次，加入二抗(1200)，黑暗中孵育 2 h，洗 3 次，100 g/L 甘油封片. 在荧光显微镜下观察. F 肌动蛋白的染色观察 : 室温下培养物中加入 0.5 mg/L phalloidinFITC(1200)孵育 45 min. 立即在荧光显微镜下观察. 抗 calretinin 染色: 载有培养细胞的盖玻片在 40 g/L 多聚甲醛中（0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）固定 30 min，用含 100 mL/L 山羊血清，1 mL/L Triton X100 的 PBS 液阻断 20 min 后，抗 calretinin mAb (1100) 进
12、行孵育，4过夜. DPBS 液洗 3 次，加入二抗(1200) ，黑暗中孵育 2 h，洗 3 次，100 g/L 甘油封片. 在荧光显微镜下观察. BrdU 标记 : 培养的细胞中加入BrdU（11000; 5BrdU labeling and detection kit II Boehringer Mannheim GmbH Biochemica D68298 Mannheim Germany） ，其浓度为 10 mol/L. 37, 50 mL/L CO2 孵育 12 h后，用 700 mL/L 乙醇在-20固定 30 min，加入 110 抗 BrdU mAb (克隆 BMC 9318,
13、 IgG1)，在 37 孵育 30 min. 培养物置入含 1200 羊抗鼠抗体 Cy3 的 PBS 液中 90 min（避光状态）. 100 g/L 甘油封片，显微镜下观察.2 结果62.1 听囊细胞培养 14 孔细胞中有 11 孔细胞生长良好，大部分细胞在培养 8 h 后贴壁，细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态 3 种（图 1）.图 1 胎鼠听囊细胞原代培养 8 h，视野中可见到上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态1002.2 听囊细胞传代培养本研究共传 8 代，历时 4 mo，细胞形态仍主要为上皮细胞形态和成纤维细胞形态（图 2）.细胞形态和结构比较稳定. 图
14、 2 胎鼠听囊细胞培养 1 代第 6 日，细胞形态仍主 要为上皮细胞形态和成纤维细胞形态2002.3 免疫细胞化学染色观察虽然培养的听囊细胞形态有多种变化，但对细胞角蛋白和 F 肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色均呈阳性. 本研究可见到培养第 4 日细胞就增殖形成细胞克隆，细胞角蛋白（图 3A）染色呈阳性；传代细胞中，进行细胞角蛋白（图 3B）染色，结果仍表现为阳性，说明传代后上皮细胞特征维持稳定. 研究中也可见到在传代后的细胞中，F 肌动蛋白染色呈阳性（图 3C）.Calretinin 是一种钙联蛋白，是早期毛细胞的标志1. 对培养7的听囊细胞进行 calretinin 染色，在原代培养就出现
15、明显阳性的细胞（图 3D）. 这些细胞在传代后进行 calretinin 染色，结果仍为阳性着染，但强度减弱（图 3E）. 为了证实细胞培养过程中有丝分裂的存在，本研究应用了 BrdU 进行细胞核标记（图 3F） ，显示细胞具有明显的增殖活性.A：胎鼠听囊细胞原代培养第 4 日，形成了细胞克隆，细胞角蛋白的免疫荧光染色100； B：胎鼠听囊细胞 5 代，细胞角蛋白的免疫荧光染色200； C：胎鼠听囊细胞 1 代第 14 日，F 肌动蛋白的免疫荧光染色100； D：胎鼠听囊细胞原代培养第 7 日，calretinin 的免疫荧光染色200 ； E：胎鼠听囊细胞培养 1 代第 3日，calreti
16、nin 的免疫荧光染色200 ； F：胎鼠听囊细胞培养 6 代，细胞 BrdU 染色显示几乎所有培养细胞标记阳性100.图 3 免疫细胞化学染色观察3 讨论有关毛细胞再生的研究已经进行了 10 余年 . 目前，普遍的观点认为，鱼类和两栖类动物耳内终生都有毛细胞的产生，尤其是鸟类的前庭器官，有损伤后自我修复的功能. 哺乳动物毛细胞在出生后就已经停止增殖，不可能再产生. 近年来的许多研究成果令人鼓舞，8已证实哺乳动物毛细胞的再生能力，但这些现象大部分是在自然恢复的过程中观察，急需探明毛细胞增殖和分化的来源. 大部分小鼠胚胎期听囊细胞进行终末有丝分裂是在胚胎 15 d 左右，经过终末有丝分裂后分化为毛细胞. 本研究的目标为在胚胎期听囊细胞进行终末有丝分裂之前，取出听囊（胚胎 14 d） ，观察并培养听囊细胞，即毛细胞的前体细胞，从而了解这些前体细胞在体外自然培养条件下的增殖和分化情况.以往许多研究者应用 H2kbtsA58 转
