《细胞膜表达的HLAG诱导免疫耐受性树突状细胞的产生》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞膜表达的HLAG诱导免疫耐受性树突状细胞的产生（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1细胞膜表达的 HLAG诱导免疫耐受性树突状细胞的产生作者：周浩黎纬明张敏刘峥嵘邹萍【摘要 】 为了探讨体外诱导免疫耐受性树突状细胞(dendritic cell, DC)产生的方法及其机制，利用人 HLAG1 真核表达载体转染 K562 细胞并与 DC 共培养后，用流式细胞术检测 DC表面 CD80、CD86 、 ILT3 和 ILT4 分子表达情况，同时采用氚胸腺嘧啶核苷（3HTdR ）掺入法检测 DC 对 T 细胞功能的影响。结果表明，膜表达的 HLAG1 分子与树突状细胞作用后，DC 表面免疫共刺激分子 CD80、CD86 表达下调，而抑制性分子 ILT3、ILT4 表达上调。HLAG
2、1 作用后 DC 异基因抗原诱导淋巴细胞增殖的活性明显下降。结论：HLAG1 分子可以在体外条件下，下调 DC 表面免疫共刺激分子水平，促进 ILT3、ILT4 表达，诱导免疫耐受性树突状细胞产生。 【关键词】 树突状细胞；HLAG ；T 淋巴细胞；免疫耐受Induction of Tolerogenic Dendritic Cells by MembraneBound HLAG2Abstract In order to study how to induce tolerogenic dendritic cells in vitro and its mechanism, the K562 ce
3、lls transduced with HLAG construct were used to coculture with DC. Then their related immunological changes, such as membrane molecules CD80, CD86, ILT3 and ILT4 expression levels were detected by flow cytometry. Allogeneic proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) was detected by
4、mixed lymphocyte reaction. The results showed that CD80 and CD86 expressions on DC were downregulated, while ILT3 and ILT4 expressions were upregulated after coculturing with K562HLAG cells. The DCs were less able to stimulate the allogenic PBMNC. It is concluded that the membranebound HLAG can upre
5、gulate expression of inhibitory receptors ILT3 and ILT4, inducing tolerogenic DC in vitro, which may provide a novel strategy for transplant tolerance induction.Key words dendritic cell; HLAG; T lymphocyte; immune tolerance移植排斥所导致的移植物抗宿主病（GVHD）是骨髓移植领域的3难题。目前临床免疫抑制剂的应用虽然可以显著降低急性 GVHD 的发生，但是慢性 GVHD 损害
6、的发生仍然难以克服。诱导受者外周免疫耐受被认为可能成为解决移植后慢性 GVHD 的有效途径1 。树突状细胞（dendritic cell，DC ）是体内功能最强的专业性抗原呈递细胞，是活化初始 CD4+T 细胞最有效的抗原呈递细胞。近年来，人们逐渐认识到 DC 在外周免疫耐受中的作用，并寻找诱导免疫耐受性树突状细胞产生的有效途径2 。免疫耐受性树突状细胞膜上高表达 ILT3 和 ILT4 分子，它们的可能配体是 HLAG3 。研究发现，HLAG 促进心脏移植后的外周免疫耐受状态的产生，其机制可能与诱导树突状细胞耐受有关4 。本实验希望通过对HLAG 诱导 DC 免疫耐受的机制的研究，探讨诱导免
7、疫耐受性 DC产生的新的有效方法。材料和方法主要试剂、细胞株及 HLAG1 真核表达质粒RPMI 1640 培养液、 DMEM 培养液、G418 、TRIZOL 一步法提取 RNA 试剂及逆转录试剂盒均购于 Gibco 公司，Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂盒购于 Invitrogen 公司，小牛血清购于杭州四季青公司。慢性粒细胞白血病细胞株 K562、 绒毛膜癌细胞株JEG3 细胞来源于 ATCC，培养于含 15% 小牛血清的 RPMI 1640 4培养液中。 包括人 HLAG1 全长 cDNA 的真核表达质粒由 Carole Ober 博士惠赠。K562 细胞的转染及药
8、物筛选脂质体介导的真核细胞转染技术参照 Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂盒说明进行。转染细胞在 800 g/ml 浓度 G418 条件下筛选稳定株。稳定转染细胞株表示为 K562HLAG1，转染空载体的细胞株表示为 K562RSV。抗体和流式细胞术小鼠抗人 HLAG1 单克隆抗体(MEMG/9) 购自 BioVender公司。小鼠抗人 HLADR、 CD1a、ILT3、ILT4、CD80、CD86抗体，PE 标记小鼠抗人 CD1a 抗体均购自 R&D 公司。FITC标记山羊抗小鼠 IgG 抗体、山羊抗小鼠 IgG 免疫磁珠购自晶美公司。流式细胞术分析前，将细胞与含 20%人
9、血清的 PBS 作用以封闭 Fc受体。并用同型对照抗体以系统性消除非特异性结合。流式细胞分析采用 CellQuest 软件。外周血来源树突状细胞培养及细胞的共培养5取新鲜的人肝素抗凝外周血 20 ml，用 PBS 以 11 的比例稀释后沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，2 000g 离心 20 分钟后取白膜层细胞，用 PBS 以 1 500g 离心 10 分钟 洗涤 2 次，并用 RPMI 1640 以 1 000g 离心 10 分钟，洗涤 1 次，最后用含10%(v/ v)胎牛血清 RPMI 1640 完全培养液重悬细胞，以 2106 cells/ml 细胞浓度加到 24 孔培养板中，每孔
10、 1 ml 。放置 37 、5 % CO2 孵箱内孵育 2 小时，吸弃细胞悬液，用 RPMI 1640 轻洗3 次洗去非黏附细胞,获得粘附细胞，分别按 1106 U/ L 、5105 U/ L 终浓度加入细胞因子 GMCSF 和 IL4。间日更换 1/2 体积培养液并加入相当首次浓度半量的细胞因子。倒置显微镜逐日观察细胞生长状况，培养 7 天收集未成熟树突状细胞（immature DC，iDC ） 。在 iDC 与 K562HLAG1 细胞共培养试验中，将 iDC与 K562HLAG1 细胞分别以 1106 cells/mL 和 1105 cells/ml 混合培养 48 小时。通过小鼠抗人
11、CD1a 抗体和山羊抗小鼠免疫磁珠联合分离出混合培养体系中的树突状细胞。混合淋巴细胞反应以新鲜分离的另一健康志愿者来源的外周血单个核细胞（PBMNC）作为反应细胞。以 K562 细胞共同培养后的 DC 经过30 Gy 射线灭活后作为刺激细胞，以 104 和 105 数量分别接种到96 孔板，反应细胞以 105 数量接种，每次反应均设 3 个复孔。6CO2 孵箱培养 5 天，加 3HTdR，再培养 12 小时后，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，干燥后用液闪法测定并计算刺激指数（SI） 。统计学处理应用 SPSS 11.0 软件分析结果，组间数据比较用 t 检验，以P0.05 为具有统计学意义。结 果转
12、染细胞的间接免疫荧光检测将转染 48 小时后的 K562 细胞进行间接免疫荧光检测。转染HLAG1 的 K562 细胞显示出绿色荧光。证明所构建的 HLAG1真核表达载体可以在 K562 细胞上正确表达（图 1A） 。转染细胞 HLAG1 水平的流式细胞术检测检测显示，转染空载体的 K562 细胞表面无 HLAG1 表达，而HLAG1K562 细胞表达 HLAG1，经过 G418 筛选后纯度超过98.2%。此结果说明已经成功建立稳定表达 HLAG1 的 K562 细胞株（图 1B） 。7外周血来源树突状细胞鉴定培养 6 天后可见较多形态不规则的悬浮细胞，数个细胞呈团状悬浮。普通光镜下见细胞有大
13、量毛刺，符合树突状细胞的形态。流式细胞术分析树突状细胞表型，检测 MHC类分子（HLADR ） ，结果显示细胞低表达 HLADR （16.7%） 、 CD1a （21.9% ） 、 CD80 （24.6%） 、 CD86 （31.9%） ，此检测结果符合文献报道的不成熟树突状细胞表型（图 2） 。Figure 2. Detection of membrane molecules on PBMNCderived DCs.外周血单个核细胞来源树突状细胞与 K562HLAG1 细胞共培养分成 3 组， 第 1 组是未成熟树突状细胞单独培养；第 2 组是树突状细胞与 K562HLAG1 细胞共培养，第
14、 3 组是树突状细胞与空载体 K562RSV 细胞共培养。流式细胞术检测树突状细胞的表面分子表达，CD80 ，CD86 分子表达水平下调（分别为 15.7与22.1） （图 3） 。而免疫抑制性分子 ILT3，ILT4 表达水平上调（图4） 。8Figure 3. CD80 and CD86 expression on DCs after coculturing with K562HLA-G1 cells for 48 hours.Figure 4. Expression of ILT3 and ILT4 on dendri tic cells after coculturing with K
15、562HLAG1 cells for 48 hours.HLAG 作用后的 DC 刺激 T 细胞增殖功能受到抑制对照组中 DC 与 K562RSV 共培养 48 小时之后，分选出 DC 再与同种异体来源的外周血单个核细胞（PBMNC）共同培养 5 天，DC 表现出很强的促进 PBMNC 针对同种异基因抗原的增殖能力，而 DC 与 K562HLAG1 共培养 48 小时后， 其刺激 PBMNC 同种异基因抗原增殖的能力被抑制（图 5） 。Figure 5. Proliferation of allogeneic PBMNC sti mulated by DCs. 讨 论树突状细胞被认为在维持机体
16、免疫耐受中发挥重要作用。在中枢耐受形成过程中，胸腺树突状细胞通过呈递自身抗原，参与完成 T细胞的阴性选择。最近研究发现，在外周耐受的形成和维持过程中，DC 也起到了重要作用 2 。在心脏移植后的小鼠体内，发现有耐受性 DC 存在，它们发挥免疫抑制的作用，可以诱导抗原特异性的CD4+ CD25+T 细胞和 CD8+ CD28-T 细胞产生，从而抑制下游免9疫细胞活化级联反应，有利于外周免疫耐受的形成和维持。这群细胞具有特殊的免疫表型，即高表达免疫球蛋白样转录物（leukocyte immunoglobulinlike receptor）ILT3 和 ILT45 。Takai 等6通过研究发现，HLAG 是 ILT3 和 ILT4 的配体之一，HLAG 可以和细胞表面的 ILT3，ILT4 分子结合
