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1、- 1 -细胞生物学教学大纲第一章 绪论第一节 细胞生物学的研究对象和范围细胞生物学是从细胞整体、超微结构和分子水平上研究细胞的结构和生命活动规律的学科。细胞生物学研究对象细胞是一切生物的基本结构单位，它是由膜围成的能独立进行繁殖的最小原生质团。细胞生物学研究范围细胞的结构显微结构：在光学显微镜下细胞的结构亚显微结构：超微结构, 电子显微镜下细胞的结构细胞的功能物质的吸收与分泌、合成与分解、增殖与分化、衰老与死亡、信息传递与转导以及遗传与变异等等第二节 细胞生物学的发展简史细胞的发现细胞学说的创立和细胞学的形成电镜下的细胞和细胞生物学的兴起分子细胞生物学的出现细胞的发现最早发现细胞的是 Rob
2、ert Hooke1665 年从木栓中发现蜂巢状小室 细胞。创造了第一架有科研价值的显微镜，放大倍数 40140倍细胞的发现第一次（1674 年）观察到活细胞的是 A.V.Leeuwenhoek发现了池塘中的原生动物观察到了哺乳动物的精子自制显微镜，放大倍数达 500 倍细胞学说的创立和细胞学的形成1838 年，德国植物学家 Schleidon 提出：所有的植物体都是由细胞组合而成的细胞学说的创立和细胞学的形成1839 年，德国动物学家 T.Schwann 认为：动物体也是由细胞组成的，并肯定一切生物体都是由细胞组成的细胞学说的创立和细胞学的形成二人的观点就是著名的“ 细胞学说 ”（cell
3、theory) ， M.Schleidon 和 T.Schwann 同时成为细胞学说创始人。1855 年，德国病理学家 R.Virchow 提出：“细胞来自细胞”，对细胞学说做了重要补充。“细胞学说”主要内容细胞是多细胞生物的最小结构单位，对单细胞生物来说，一个细胞就是一个个体；多细胞生物的每一个细胞即是一个活动单位，执行特定的功能；细胞只能由细胞分裂而来。原生质理论1835 年， E.Dujardin 发现了动物细胞中的粘液质，将其称为“肉样质”(sarcode)；1840 年， Purkinje 发现了植物细胞中的物质，将其称为“原生质”（protoplasm） ；原生质学说 细胞是有膜包
4、围的原生质团细胞学的经典时期细胞结构的重要发现1880 年，T.Boveri 发现中心体1898 年，C.Benda 发现线粒体1898 年，C.Golgi 发现高尔基体细胞功能的重要发现1885 年，W.Flemming 发现并提出有丝分裂1905 年，J.E.Moore 等发现并提出减数分裂细胞学的形成O.Hertwig 于 1892 年发表了 细胞与组织的著名著作 ，这一著作标志着细胞学（Cytology）作为一门独立的生物学科的建立。 Wilson,E.B.于 1896 年发表了名为发育和遗传中的细胞一书，成为细胞学史上第一部有系统的细胞学。电镜下的细胞和细胞生物学的兴起1933 年，
5、德国科学家 Ruska（鲁斯卡）在西门子公司（Siemens）设计制造出世界上第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的放大倍数。分子细胞生物学的出现20 世纪 60 年代，人们发现基质中有微管、微丝的存在，并构成纵横交错的骨架，总称细胞骨架(cytoskeleton ） ；细胞骨架的发现是细胞超微结构研究方面的重大进展。同时由于分子生物学的发展，将细胞生物学带入分子时代。第三节 细胞生物学的研究进展对生物膜、线粒体、核糖体、细胞骨架以及染色体等的分子结构和功能研究方面取得了深入进展。在基因组结构和基因表达与蛋白质合成方面取得了大量成果。细胞工程领域硕果累累单克隆抗体制备转基因动物、转基因植物的开发
6、与利用克隆技术的研究胚胎与组织干细胞研究的广泛开展第二章 细胞生物学研究方法第一节 形态结构一、光学显微镜（一）普通光学显微镜影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率分辨率是指显微镜能将相近的两个质点分辨清楚的能力 分辨率（resolution ）公式：D= 0.61 / N.A. D 分辨率 光波波长 N. A. 镜口率（数字孔径） N. A. =N Sin /2 （二）特殊显微镜暗场显微镜原理：显微镜加装特殊装置，使直射光不能进入物镜，只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜特点：视野的背景是暗的，样品是的边缘是亮的。特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野聚光器相差显微镜（
7、phase contrast microscope）二、电子显微镜- 2 -电子显微镜以电子束代替了可见光，大大提高了显微镜的分辨率，可以观察细胞的亚显微结构电子束的波长与电压成反比，波长极短 例如，电压为 6 万伏，则=0.0488 埃比最短的可见光 4000 埃约小 10 万倍电镜的基本构造：电镜与光镜的主要区别： 光学显微镜 电子显微镜 光源 可见光 电子束 介质 空气（香柏油） 真空 聚光镜 光学透镜 电磁透镜分辨力 0.2um 0.1nm放大倍数 1000 倍 百万倍 电子显微镜主要种类：透射式电子显微镜(TEM) 主要用于观察标本内部细微结构扫描式电子显微镜（SEM) 主要用于观察
8、标本表面形态结构扫描隧道显微镜（STM）电镜技术：冰冻断裂和冰冻蚀刻冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术：（freezefracture;freezeetching）目的：主要用于研究生物膜结构主要步骤：冰冻标本（-100 0C 干冰或-196 0C 液氮） ，冷刀断开标本（冰冻断裂） ，升温，冰升华，断裂面结构暴露（蚀刻） ，表面喷一层蒸汽碳和铂，将组织溶掉，碳和铂的膜称复膜（replica） ，电镜下观察复膜，复膜构造=标本构造扫描隧道显微镜（STM） （scanning tunneling microscope）可观察晶体表面原子图像主要部件扫描探针由钨丝或白金丝制成，直径几个埃原理：电子在样品与
9、探针之间（距离几个埃）转移可形成隧道电流，当优点：分辨力高；三维图像；电压低（2mV2V） ；不用真空（常压、液态） ；速度快。第二节 生物化学分析一、组织化学法*利用染色的方法进行原位分析* 福尔根（Feulgen）反应：鉴定 DNA*PAS 反应（高碘酸席夫反应）：鉴定多糖类物质 二者皆有醛基与 Schiff 试剂反应，生成红色化合物 二、免疫细胞化学特异蛋白抗原的定性与定位方法：原位分析 ；体外蛋白质分析 （一） 原位分析 ：免疫反应 ：直接法：Ag+Ab* 镜检；间接法： Ag+Ab1+ Ab2*镜检。*代表标记物标记物可以为多种：荧光素 免疫荧光技术或称荧光抗体法，酶酶标抗体法，放射
10、性同位素标记放射自显影，铁蛋白标记，免疫胶体金技术（二）体外蛋白质分析蛋白质印迹法（Western blotting）技术路线 ： （图）样品制备样品分离样品转移免疫反应检测蛋白质由 SDS 聚丙烯凝胶 硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹（blotting）三、显微光谱分析技术定量细胞化学分析技术细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）流式细胞术（Flow Cytometry）流式细胞术*仪器：流式细胞计flow cytometer*特点：细胞是高速运动的*主要应用：用于定量测定细胞中的 DNA、RNA 或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中
11、分离某些特异染色的细胞；分离 DNA 含量不同的中期染色体；混合细胞分离 。五、超离心技术（ultracentrifugation ）高速离心：1000025000r/min；超速离心：转速大于25000r/min 沉降系数（ “S”Svedberg unit）: 单位离心场中溶质分子的沉降速度 。1S 相当于 110-13s 离心目的：分离细胞器与生物大分子及其复合物离心种类：分析离心：用于分析和测定制剂中的大分子的种类和性质等制备离心 差速离心：分离密度不同的细胞组分密度剃度离心：精细组分或生物大分子的分离（介质蔗糖、氯化铯）六、分子杂交技术细胞内特异核酸的定性定位原位杂交光镜水平的原位杂
12、交技术同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平的原位杂交技术 生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合体外分析核酸的主要方法： Southern blotting 又称DNA 印迹法；Northern blotting 又称 RNA 印迹法原位杂交（in situ hybridization）分子杂交（molecular hybridization）是利用 DNA 高温变性、低温复性原理形成杂交分子的过程杂交分子形式：DNADNA ；DNA RNA；RNARNA原位杂交是在分子杂交基础上建立起来的七、PCR 技术聚合酶链式反应；引物：寡核苷酸链；原料：d NTP；酶：DNA 聚合酶（耐高
13、温）第三节 细胞生理学技术1、膜电位检测技术细胞内外存在电位差（20100mV）称为膜电位，膜电位的变化反应了细胞的生理变化2、膜片钳位记录技术- 3 -主要用于检测单个特定离子通道性 质及变化3、细胞电泳细胞表面带有许多电荷，因而可以在外加电场的作用下移动第四节 实验操作技术一、细胞培养（cell culture）动物细胞培养植物细胞培养（一）动物细胞培养细胞培养主要方式克隆培养（clonal culture）：克隆又称无性繁殖系或无性系群体培养（mass culture）体外培养细胞生长特点：单层细胞培养贴壁生长；接触抑制现象转鼓培养法为了大量获取细胞而使细胞始终悬浮不贴壁的培养方法细胞培
14、养相关概念：原代培养（primary culture）：从机体中取出细胞后直接培养，得到原代细胞（一般指分裂 10 代以内的细胞） 。分离细胞的主要方法传代培养（subculture）：适合在体外进行的持续性培养，传代培养的细胞称传代细胞。细胞株（cell strain ）在培养过程中仍然保持其特征（二倍体）及接触抑制的传代细胞。细胞系（cell line）在培养条件下发生突变后可以无限增殖的细胞群，接触抑制丧失。 例：HeLa 细胞系；CHO 细胞系动物细胞的无血清培养：在培养液当中不加血清，从而去除因血清成分复杂对实验结果的影响。细胞培养常需要从组织中分离细胞分离细胞的主要方法酶法：动物组
15、织胰蛋白酶；植物组织果胶酶非酶法：EDTA 与 Ca2+螯合 （二）植物细胞培养植物细胞再生植株植物细胞培养分为：花药或花粉培养；胚和胚株培养； 颈顶端培养；叶肉细胞培养；原生质体培养1、花药或花粉培养花粉 培养液 愈伤组织 分化培养基 长出茎叶 另一分化培养基 根形成 花 盆 植株5、原生质体培养植物细胞 纤维素酶、果胶酶去壁 原生质体 高渗培养基 生成细胞壁 分化培养基 愈伤组织二、显微操作术：micromanipulation 显微操作仪三、细胞融合细胞杂交技术（cell hybridization）单克隆抗体技术（monoclonal antibody）细胞拆和1、物理法：针、管、光；2、化学法：细胞松弛素 B核体（小细胞） ；胞质体四、核型与染色体显带核型染色体显带 Q 带：喹丫因染色；G 带：吉姆萨（Giemsa）染色； C 带：染着丝粒 R 带：“反带” ；T 带：丫啶橙， “端粒带” ；N 带：Ag 染法第三章 细胞的基本概念第一节 细胞的基本特征*细胞的基本概念细胞：有膜包围
