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1、SDS-PAGE 电泳问题总结 (2012-04-19 20:07:12)转载标签： 杂谈 分类： 常用技术蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善胶凝的快慢不在于 TEMED 多少，在于 APS 的量，APS 提供自由基，TEMED 帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大 APS 的量丙烯酰胺在凝胶中的百分比 分离胶的分辨范围15 1545 kDa12.5 1560 kDa10 1875 kDa7.5 30120kDa5 60212kDa来
2、源于蛋白质技术手册汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通 TRIS 缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和 SDS 环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER 配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约 15K
3、Da 左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE 已经几乎到了极限，还跑不出来的 MARK 带，就不必去追究商品的问题了SDS-PAGE 胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和 TEMED 的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。做 SDS-PAGE 的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的 band 能做到一样宽，方便后面的比较，特别是 WB。做法就是拿 1X 的上样缓冲补全要加的样做到体积一致
4、，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的加入染色液后，先放入微波炉里加热 5-10 秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了） 。然后放水平摇床上摇 20 分钟，最多半小时就染好了。脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸 5 分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上 1/5 的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液） 。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。在做蛋白表达的时候，包涵体的出现常常令大家头疼不已， 现在给大家推荐
5、盐离子染SDS-PAGE 的方法，这种方法简单快速还干净，适合于切胶免疫的同学，具体操作就是把配好的 0.5M 的氯化钾放在冰箱预冷，然后加在胶上慢慢晃动，大约 5 分钟就可以看见你的蛋白条带，切胶回收后直接乳化免疫，不会有什么影响。如果无法识别，还可以再用实验室传统的方法染色！拍胶时的“黑十字”聚焦法！很多人用相机的微距聚焦都无法使识别框变绿，其实你只需要在胶所在的平面划一个黑十字就可以很好的聚焦，尤其是 western blot 的图，直接在膜的边上划就可以聚焦SDSPAGE 的话可以找个颜色深东西放在胶的边上就可以了，把镜头对准它SDS-PAGE Laemmli 法这种方法帖出来，大家是
6、不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用 Laemmli 法跑电泳的。如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于 Laemmli 于 1970 年发表在 nature 上的一篇文章中的方法,这篇文章很特别, 不仅被引用的次数较多,而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题,而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已,所以阐述如何操作的文字只有那么一小段(但相当经典), 这是 SDS-PAGE(不连续系统)的首次成功应用。现在我们在实验室进行的 SDS-PAGE 试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其 SDS-PAGE 时引用 L
7、aemmli 方法,目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续 SDS-PAGE 的基础的确来自 Laemmli 方法,但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。 你也许会恍然大悟：原来我们用的就是 Laemmli！借鉴 Tricine-SDS-PAGE 中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验，在普通的 SDS-PAGE中加入约 13%的甘油，同样可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。只要把原来配方中的水换成 60%的甘油，就可以了。在分离胶中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改变胶的孔径！特别是对分离糖蛋白的时候很有用处！一方面可以把条带压窄，减少拖尾现象的产生,另一方面对分离小分子量的蛋白有
8、好处!一般加的量在 0.53g 尿素/12ml 分离胶！自己可以跑来实验一下你跑9KD分子量的蛋白，建议用 tricine-sds-page 电泳来跑！也可以在分离胶中加尿素！自我经验来看，加尿素会好于甘油！Q：SDSPAGE 电泳的基本原理？A：SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS（十二烷基硫酸钠） ， SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4g 去污剂结合。当分子量在15KD 到
9、 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X 为迁移率，k 、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在 SDSPAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 TrisHCL 缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶 pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 CL 离子
10、却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了 较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。Q：样品如何处理？A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的
11、还原 SDS 处理。 1、还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT（或-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样 Buffer，离心，沸水煮 5min，再离心加样。2 、带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul 样品缓冲液中 10ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温 30min。3、非还原 SDS 处理：生理体液、
12、血清、尿素等样品，一般只用 1SDS 沸水中煮 3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。Q：SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用？A：聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择 trisHCl 系统，具体作用后面介绍；TEMED 与 AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。Q：提高 SDS-PAGE 电泳分辨
13、率的途径？A：1 、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。Q：“微笑 ”（两边翘起中间凹下）形带原因？A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。Q：“皱眉 ”（两边向下中间鼓起）形带原因？A：主要出现在蛋
14、白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。Q：为什么带出现拖尾现象？A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。Q：为什么带出现纹理现象？A：主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。Q：什么是“鬼带” ，如何处理？A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被
15、解离的蛋白质分子重新折叠结合和和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA 来阻止还原剂的氧化。Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer；降低分离胶的浓度。Q：为什么电泳的条带很粗？A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确（6.7 ） ；适当降低电压；Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？A：这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上，可电流却在 5mA 以下。主要是由于电 泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮） 。处理办法：电泳槽电泳槽正确装配即可。Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而
