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1、ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2008 年 4 月 8 日;16(10): 1098-1104 文献综述 REVIEW幽门螺杆菌培养及抗原蛋白的分离纯化赵圣国, 王加启, 刘光磊, 程金波, 张春刚 赵圣国, 王加启, 刘光磊, 程金波, 张春刚, 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室 北京市 100094国家“十一五”科技攻关奶业重大专项资助项目, No. 2006BAD04A03作者贡献分布: 赵圣国对此文做主要贡献; 此课题由王加启提出设计; 刘光磊, 程金波和张春刚对本文修改和审阅; 文章思路及写作由赵圣国完成.通讯作者:
2、 王加启, 100094, 北京市圆明园西路 2 号, 中国农科院北京畜牧兽医研究所. wang-jia-电话: 010-62810458收稿日期: 2007-09-13 修回日期: 2008-02-27Culture of Helicobacter pylori and purification of antigen protein Sheng-Guo Zhao, Jia-Qi Wang, Guang-Lei Liu, Jin-Bo Cheng, Chun-Gang ZhangSheng-Guo Zhao, Jia-Qi Wang, Guang-Lei Liu, Jin-Bo Cheng,
3、Chun-Gang Zhang, State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100094, ChinaSupported by: the Dairy Momentous Project of National Key Technology R&D Program during the 11th Five-Year Plan Period, No. 2006BAD04A03Correspondence
4、 to: Jia-Qi Wang, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Science, 2 Yuanmingyuan Western Road, Beijing 100094, China. wang-jia-Received: 2007-09-13 Revised: 2008-02-27 AbstractHelicobacter pylori (H pylori) live in the stomach of human. It is a kind of curve bacteria which can
5、lead to chronic gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. Usually, antibiotics are used to treat the patients, but they have a lot of side effects. Milk of milch cow immunized with H pylori vaccine can prevent and treat the infection of H pylori without side effects. During the production of immun
6、e milk, the basic work is to prepare vaccine. During the preparation of sub-unit vaccine, key is to isolate and purify the antigen protein. In this article, we discuss the culture of H pylori (solid and liquid culture), the recombinant expression and purification of its antigen protein (urease, VacA
7、, CagA and lipopolysaccharide).Key Words: Helicobacter pylori; Culture; Urease; Vacuolization cytotoxin A; Cytotoxin associated antigen A; LipopolysaccharidesZhao SG, Wang JQ, Liu GL, Cheng JB, Zhang CG. Culture of Helicobacter pylori and purification of antigen protein. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi
8、2008; 16(10): 1098-1104摘要幽门螺杆菌( H pylori)是一种生存于人胃中的弯曲状菌, 能导致人的慢性胃炎, 消化性溃疡和胃癌, 其治疗多用抗生素治疗, 但其副作用较大. 给奶牛免疫 H pylori 疫苗后, 其分泌的牛奶中含抗 H pylori 的免疫球蛋白, 能够预防和治疗人类 H pylori 感染, 且没副作用. 在生产免疫乳时, H pylori 疫苗制备是基础性工作, 并且在亚单位疫苗中, 抗原蛋白的制备和分离纯化又最为关键. 本文就 H pylori 的培养(固体和液体培养)和抗原蛋白(尿素酶、空泡毒素、毒素相关蛋白和脂多糖)的理化性质、重组表达以及分
9、离纯化方法进行比较研究.关键词: 幽门螺杆菌; 培养; 尿素酶; 空泡毒素; 毒素相关蛋白; 脂多糖赵圣国, 王加启, 刘光磊, 程金波, 张春刚. 世界华人消化杂志 2008; 16(10):幽门螺杆菌培养及抗原蛋白的分离纯化. 1098-1104http:/ 0 引言幽门螺杆菌( H pylori)是 1983 年从澳大利亚患者炎性胃角上皮细胞分离出来, 现已证实在全世界人群中的感染率达 50%以上, 而在我国人群中感染率则高达 58.07%1-2. 感染 H pylori 后, 能引起慢性胃炎和消化性溃疡, 还易转变成胃癌和胃 MALT 淋巴瘤 3-5. 目前主要使用抗生素进行治疗, 但
10、抗生素治疗存在一定的不良反应, 且产生耐药性. 给奶牛免疫 H pylori 疫苗后, 其分泌的牛奶中含抗 H pylori 的免疫球蛋白, 能够预防和治疗 H pylori 感染 6-9. 在此项技术中, H pylori 疫苗的制备是首当其冲的工作. H pylori 全菌疫苗抗原成分复杂, 制备疫苗存在很多困难 10-11. 而亚单位疫苗逐渐引起人们的重视, 单一 H pylori 抗原的免疫保护率几乎低于 80%, 2 种以上抗原组合可获得理想的保护效果, 显示了多价疫苗将成为今后 H pylori 疫苗研究的主要方向 12-13. 因此, 菌体抗原蛋白的制备和分离纯化显得尤为重要.
11、现就 H pylori 培养和尿素酶(Urease)、空泡毒素 A(vacuolization cytotoxin A, VacA)、毒素相关蛋白 A(cytotoxin associated antigen A, CagA)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的重组表达和分离纯化研究进展进行阐述, 为下一步免疫乳牛和生产免疫乳奠定基础. 1 H pylori 的分离培养H pylori 是一种 S 型、弧形或弯曲形的革兰氏阴性细菌, 生化反应中尿素酶阳性, 过氧化氢酶阳性, 氧化酶阳性、马尿酸钠阴性. H pylori 对营养要求较高, 在微需氧、适度温度、37环境下缓
12、慢生长, 一般需要 3-7 d 的时间才能形成针尖样半透明的小菌落 14-18(表 1). 表 1 幽门螺杆菌培养基的选择 在制备抗原疫苗时, 需要对细菌进行大量规模化培养, 常规的固体平板培养无法满足菌量需求. 所以, 用液体培养基培养细菌已越来越多的用于疫苗生产中. 但是含血清的菌液, 抗原的纯化特别困难, 多次洗涤细菌, 可能导致细菌表面蛋白的大量损失, 并且成本高 15,19-20. 实验表明, 在用添加有环糊素的液体培养基发酵细菌时, 也能得到与添加血清一样的效果. 因此, 在用液体培养基培养 H pylori 时, 常选用国际标准菌株, 在基础培养基中添加复合抗生素, 以抑制其他细
13、菌生长, 并向基础培养基中添加营养性添加剂, 如环糊精, 经过 37, 振荡箱中培养几天后, 便可以得到理想的菌体产量. 2 H pylori 的主要抗原蛋白2.1 Urease Mr = 38000030000, 等电点 5.990.03, 最适 pH8.2, Km 值 0.30.1 mmol/L. H pylori Urease 单体由 A、B两个亚单位组成, 呈六聚体, Mr分别为 620002000和 30000100021-22. Urease 被认为是最有代表性的毒素, 占细菌可溶性蛋白的 6%, 其水解产生的氨能够中和胃酸, 保护细菌本身免受伤害. 同时尿素的水解产物氢氧化铵可以
14、明显的造成组织损害, 细菌过度生长促使硝酸盐降解为亚硝酸盐及亚硝胺而产生致癌作用. 2.2 VacA 在中性环境中是无活性的, 必须在酸性环境下解离成 Mr 为 90000的单体, 才具活性. H pylori 首先编码产生 Mr约 140000的 VacA 前体蛋白, 经降解信号序列(s)及跨膜输出段后产生 Mr为 95000的分泌性活性毒素 VacA, 他是一种 AB 型毒素, 进一步降解产生 Mr为 37000的 A 亚单位与 58000的 B 亚单位 26-27. VacA 型 H pylori 菌株能导致正常细胞空泡样变、细胞凋亡、细胞骨架重排等形态学改变, 与消化性溃疡, 胃癌等密
15、切相关 28-30. 2.3 CagA 是一种具有强免疫原性的亲水性外膜蛋白, 不同菌株 CagA 的 Mr范围是 128000-140000. CagA蛋白的等电点为9.72, 是疏水性蛋白, 无前导肽及跨膜区 31-32. CagA 与 VacA 在临床上密切相关, CagA 对于 VacA 的转录后折叠、胞外运输、甚至毒素正常功能都必不可少. CagA 的存在更适于 H pylori 定居在胃黏膜上, CagA 能提高黏膜炎症反应程度. CagA 阳性的H pylori 能够引起更严重而长期的胃黏膜炎症反应, 而长期的慢性炎症易导致胃黏膜萎缩, 并发展成为慢性萎缩性胃炎, 甚至胃癌 33
16、-34. 2.4 LPS 是革兰氏阴性菌胞膜的主要组成成分, H pylori LPS 由内核和脂质 A 组成, 多糖成分主要含有半乳糖、氨基葡萄糖、葡萄糖等 36-37. H pylori 与沙门氏菌和大肠杆菌相比, 其 LPS 免疫活性更低, 因为小鼠的半数致死量, H pylori LPS 要高出大肠与沙门菌 LPS 的 500-10000倍. H pylori LPS 能加速组织胺的释放和 DNA 合成, 还能增加胃黏膜细胞的超氧阴离子, 引起胃黏膜细胞凋亡 38-39.3 抗原蛋白的制备及分离纯化3.1 抗原蛋白的制备 H pylori 中的抗原蛋白的制备, 一种方法是, 通过固体或液体培养基大量培养 H pylori 后, 直接从菌液中进行提取, 这种方法操作比较简单, 耗时少, 容易掌握. 但是 H pylori 培养比较
