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1、1正常人外周血淋巴细胞凋亡受体的表达与细胞凋亡的关系作者：胡静, 何小军, 冯永东, 杨长永，韩中博, 龚建平【摘要 】 本研究检测凋亡受体 Fas、TNFR、TNFR 在人外周血淋巴细胞(PBL)增殖过程中的表达情况及其细胞周期特异性，并探讨其与凋亡受体途径介导的细胞周期特异性细胞凋亡的关联性。应用双参数流式细胞术检测人外周血淋巴细胞在 G0 期和经植物凝集素刺激(PHA)进入细胞周期后 Fas、TNFR、TNFR的表达情况以及细胞周期特异性，同时检测肿瘤坏死因子 、抗 Fas 抗体诱导人外周血淋巴细胞的凋亡。 结果表明： 经植物凝集素刺激 24小时后的外周血淋巴细胞 Fas、TNFR 、T
2、NFR 表达率较 G0 期外周血淋巴细胞分别增加了（35.556.63）% ， （30.632.66）%， （26.625.14）%，均具有显著性差异 (P0.01)，而且主要表达在 G1 期； 未经植物凝集素刺激的外周血淋巴细胞停留在 G0 期，TNF 和 antiFas 诱导后没有发生凋亡，而刺激后进入细胞周期的淋巴细胞经 TNF 和 antiFas 诱导后发生凋亡，其凋亡主要在G1 期。 结论： 凋亡受体在外周血淋巴细胞中的表达与凋亡受体途径介导的细胞凋亡有明显的量效关系，凋亡受体途径介导细胞凋亡的细胞周期特异性与凋亡受体表达的细胞周期特异性有关，细胞凋2亡的发生与细胞是否进入细胞周期有
3、关。 【关键词】 细胞周期 细胞凋亡 人外周血淋巴细胞 细胞增殖Relationship of Apoptotic Receptor Expression in Normal Human Peripheral Blood Lymphocytes to Cell ApoptosisAbstract The aim of this study was to detect the expression and cell cycle specificity of Fas,TNFRand TNFR in human peripheral blood lymphocytes (PBL)， and to s
4、tudy the potential role of Fas ,TNFRand TNFR in cell cycle specific apoptosis. The improved doubleparameter flow cytometry was used to detect the expressions of Fas, TNFRand TNFR and cell cycle specificity in PBL which were incubated for 24 hours in the presence or absence of phytohaematoagglutinin
5、(PHA) respectively. Apoptosis induced by IgM type antiFas and TNF was detected by API method. The results showed that compared with PBL treated in the absence of PHA in G0 phase, the ratio of Fas, TNFRand TNFR expressions in PHAstimulated PBL entering cell cycle increased （35.556.63）%， （ 30.632.66）%
6、， （ 26.625.14）% 3respectively (P0.01), and mainly appeared at G1phase; no apoptosis was induced by antiFas and TNF in G0phase PBL cultured in the absence of PHA. On the contrary, the apoptosis was induced by antiFas and TNF in PBL which entered cell cycle after stumulation with PHA and mainly initia
7、ted at G1Phase. It is concluded that there is evident doseeffect relationship between apoptotic receptor and receptormediated apoptosis. Moreover, the cell cycle specificity of receptormediated apoptosis is correlated with the cell cycle specific expressions of apoptotic receptor. The induction of a
8、poptosis by apoptotic factors (antiFas and TNF) depends on whether cell entering cell cycle or not.Key words cell cycle; apoptosis; human peripheral blood lymphocytes; cell proliferationJ Exp Hematol 2007; 15(3):533-536细胞周期是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，是细胞的增殖的基础。细胞凋亡是机体维持正常细胞群体数量稳态的重要手段，它是基因调
9、控的细胞程序性的死亡，是正常机体去除不需要的细胞的严格调控的生理过程41 。细胞凋亡的途径主要包括线粒体途径和凋亡受体途径。凋亡受体途径介导的细胞凋亡是细胞凋亡的重要途径之一，当凋亡因子（如 FasL、TNF ）与凋亡受体（如 Fas、TNFR 、TNFR）结合后通过级联反应激活一系列的 caspase，最终导致细胞凋亡 2 。本研究以人正常人外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocytes， PBL）细胞为研究对象，探讨凋亡受体在 G0 期PBL 中和进入细胞周期后的 PBL 中的表达情况及其与凋亡受体途径介导 PBL 细胞凋亡之间的关联性。中国实验血液学杂志 J E
10、xp Hematol 2007; 15(3)人外周血淋巴细胞凋亡受体的表达与细胞凋亡的关系材料和方法细胞及主要试剂外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)取自健康志愿者。异硫氰酸酯荧光素(FITC)标记的膜联蛋白 V(Annexin V)、植物血凝素(phytohaematoagglutinin, PHA)购自晶美公司， 肿瘤坏死因子(TNF) 为英国 EC 公司产品，抗 Fas 抗体(Clone DX2)、FITCFas、TNFR抗体、TNFR 抗体是 Becton Dickinson 公司产品，淋巴细胞分离液为中国医学科学科院血液研究所产品。细胞处
11、理5取正常人外周血液 10 ml，加等体积生理盐水，缓慢加于淋巴细胞分离液上， 300g 离心 20 分钟后，取白膜层，加少量生理盐水，200g 离心 10 分钟，将清洗干净的淋巴细胞分别置于 2 瓶含有10 ml/L 的胎牛血清、抗生素（青霉素 10104 U/L 和链霉素 100 mg/L）和 RPMI 1640 培养液中悬浮培养，1 瓶加有丝分裂原植物凝集素（PHA） ，培养液中淋巴细胞应用终浓度为 10 g/ml，刺激其生长分裂，另 1 瓶不加 PHA，悬浮培养 24 小时。PHA 刺激的外周血淋巴细胞(3105/ml)分别加入 TNF(50 ng/ml)、antiFas(12.5 g
12、/ml)培养 24 小时后收获细胞；对照组(未加 PHA 的外周血淋巴细胞)做同样处理Fas 、TNFR、TNFR表达以及细胞周期特异性的检测Fas、TNFR、TNFR的免疫荧光单标直接标记法标记 离心去除细胞培养液，用 PBS(pH 7. 4)洗涤，悬浮制成单淋巴细胞悬液(1106ml)，取 50 l 该悬液加入荧光 FITI 标记的单克隆抗体 0.5 l，对照组用 PBS 孵育， 4 避光反应 1 小时，用 PBS 3 ml 混匀， 80g 离心 10 分钟，弃上清，用 PBS 再洗 1 次,用 500 l PBS 悬浮细胞，避光反应 1 小时后上流式细胞仪检测。6Fas、TNFR、TNF
13、R表达的细胞周期特异性的免疫荧光双标直接标记法检测 前期 Fas、TNFR 、TNFR的标记同前，接着用1%不含甲醇的甲醛固定 20 分钟，用 PBS 3 ml 混匀， 80g 离心10 分钟，弃上清，用 PBS 再洗 1 次，加 PI 液 500 l，避光反应 1小时后上流式细胞仪检测。细胞凋亡周期特异性的 API 法检测向收获细胞加入 Annexin VFITC 5 l 后， 室温避光 30 分钟，以预冷的 binding buffer 洗涤 1 次，加入 1 ml 1%不含甲醇的甲醛，冰上固定 30 分钟后以 binding buffer 洗涤 2 次，加入 0.5 ml PI染液(50
14、 g/ml PI， 500 g/ml digitonin， 10 mmol PIPES， 2 mmol CaCl2， 0.1 mol NaCl)，1 小时后上流式细胞仪检测。统计学处理应用 SAS 8.1 for windows 统计分析软件进行 t 检验。结 果加入 PHA 的正常人外周血淋巴细胞进入细胞周期的鉴定DNA 直方图显示处于静止期的外周血淋巴细胞加入 PHA 后进入7细胞周期出现了明显的 S、G2-M 期细胞(图 1)。Figure 1. Cell cycle change of PBL cultured in the absence of PHA and PBL stimula
15、ted with PHA for 24 hours.Fas 、TNFR、TNFR表达正常人外周血淋巴细胞经 PHA 刺激后 Fas、TNFR、TNFR 表达明显增高，即 FITC 标记的荧光高度增加(图 2) ，并且Fas、TNFR、TNFR 表达率较 G0 期 PBL 分别增加了（35.556.63）%， （ 30.632.66）%， （ 26.625.14）% ，差异均具有显著性(P0.01)(图 3)。Fas 、TNFR、TNFR表达的细胞周期特异性经 PHA 刺激后，正常人外周血淋巴细胞Fas、TNFR、TNFR表达在 G1 期( 图 4)。细胞凋亡的细胞周期特异性TNF、 antiF
16、as 诱导的 PHA 刺激的外周血淋巴细胞，细胞凋亡发生在 G1 期，对照组未加 PHA， 经 TNF、 antiFas 诱8导 24 小时后，没有明显的凋亡细胞(图 5)。讨 论增殖与分化是正常机体生命活动发展的一面，其中细胞周期是增殖的前提和基础3 ，凋亡则是机体生命活动衰退的一面。凋亡和增殖分化对立统一于正常机体的生命活动之中。以前研究表明，细胞凋亡是一个细胞周期事件4,5 。凋亡受体途径介导细胞凋亡是凋亡发生的主要途径之一。在此途径中，凋亡受体的表达以及参与细胞周期途径中的主要物质，如细胞周期蛋白（cyclin) 、依赖细胞周期蛋白的激酶（CDK）等起着重要的作用 2,6 。但是，凋亡受体途径介导的细胞凋亡的细胞周期特异性与凋亡受体的表达是否有关
