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1、产品信息和操作指南Human Perforin 预包被 ELISA kitCat# : DKW12-1830-048 / DKW12-1830-096本试剂盒专用于科研，而非用于诊断Human PerforinDKW12-1830目 录产品简介 1知识背景 1试剂盒提供的试剂 2需要实验者自行准备的试剂与仪器 2注意事项 3试剂的配制 5操作过程 7结果分析 9试剂盒的保存 9操作步骤一览表 10参考文献 11ELISA 测定中可能会出现的问题及解决方法12预包被 ELISA 试剂盒系列产品 15- 1 -1、 产品简介：Quick EIATM 人 Perforin ELISA 试剂盒是通过酶
2、联免疫吸附技术，体外定量检测人血清、血浆、缓冲液或细胞培养液中的Perforin，可同时检测天然的和重组的 Perforin。本试剂盒为预包被板，整个过程孵育时间不超过 3hr，洗涤 6 次。本试剂盒专用于科研，而非用于诊断。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂盒组分，若有任何疑问请与达科为生物技术有限公司联系，E-mail：RD. 检测范围：4000-62.5 pg/ml灵敏度：40 pg/ml重复性：板内、板间变异系数均10。2、 知识背景：Perforin 又称成孔蛋白 (pore-forming protein，PFP)、溶细胞素 (cytolysin)，是一个 70 kDa 的溶细胞蛋白
3、，在 NK 细胞和细胞毒性 T 淋巴细胞的胞浆颗粒里表达，是 NK 细胞和细胞毒性 T 淋巴细胞介导靶细胞溶解的主要效应分子之一（1，2） 。- 2 -3、 试剂盒提供的试剂：试剂 规格 配制Cytokine standard 2/1 瓶* 干粉状，按瓶上说明操作Biotinylated antibody 2/1 瓶* 1：50 用 Dilution buffer R（1）稀释Streptavidin-HRP 2/1 瓶* 1：100 用 Dilution buffer R（1）稀释Dilution buffer R（ 1）3/2 瓶* 即用型Washing buffer（50 ） 1 瓶 1
4、50 用蒸馏水稀释TMB 1 瓶 即用型Stop solution 1 瓶 即用型Precoated ELISA plate 812 或86* 即用型封板膜 2/1 张* 即用型说明书 1 份*：96/48 Tests4、 需要实验者自行准备的试剂与仪器：1 酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）2 微量加液器及吸头：P10 ，P50，P100，P200，P10003 蒸馏水或去离子水4 全新滤纸5 旋涡振荡器和磁力搅拌器- 3 -5、 注意事项：1 试剂应按瓶上标签说明储存，使用前 室温平衡 20-30min。实验前室温平衡对 Washing buffer（50 ） 、Dilution bu
5、ffer R（ 1） 、 Precoated ELISA plate 和 TMB 有重要意义。2 冻干标准品冰上操作，按照标签说明溶解干粉， 充分混匀 ，按照一次使用量分装，-20贮存，避免反复冻融。3 预包被板条使用前，请恢复到室温后再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中， 密闭封口 ，4可保存1 个月。其余不用试剂应包装好或盖好。4 Washing buffer（50）在 4保存可能有 结晶析出 ，使用前务必使结晶完全溶解后（如加热、平衡温度后混匀等）再配置成 Washing buffer（1）工作液。5 HRP 和检测抗体体积量很小，使用前请 高速短暂离心 管子，以使管壁或瓶盖的
6、液体沉积到管底。6 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。7 使用前检查试剂盒内各种试剂；试剂稀释、加样和中止反应充分混匀或者摇匀对实验结果尤为重要，最好使用低速频率振荡器或者反应过程中每 15 分钟手工摇匀一次。8 实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。9 使用洁净的塑料容器盛装洗涤液。- 4 -10洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。11TMB 对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免金属接触影响结果。 有毒，避免用手接触！ 准备使用的 TMB 若变为蓝色，表明 TMB 已经污染，请丢弃。请在终止反应后
7、10min 内读取 OD 值。12请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育。冬季室内温度偏低，请使用 恒温箱或培养箱孵育 为好。13试剂盒在保质期内使用，且不同批号试剂不要混用。144000pg/ml 以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。大于 4000pg/ml Perforin 的样品应以Dilution buffer R(1)稀释后重做。在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。15特异性：不与人其它细胞因子反应- 5 -6、试剂的配制：1 提前 20 分钟将 Washing buffer(50)和即用溶液从试剂盒中取出，以平衡至室温。2 Cytokine standard：
8、Standard 为冻干粉。先按标签说明将冻干粉溶解，静置 510 分钟，再用 Dilution buffer R（1）稀释到推荐检测浓度。标准品溶解后混匀，准确倍比稀释，严格操作非常重要。标准品的倍比稀释最好在进口的或者硅化的EP 管中完成，减少非特异性吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。母液若没有用完请按照一次用量分装，-20保存。* 推荐标准品浓度梯度为：4000pg/ml、2000 pg/ml、1000pg/ml、500 pg/ml、250pg/ml、125 pg/ml、62.5pg/ml。3 Biotinylated antibody：150 用 D
9、ilution buffer R(1)稀释，混匀制成 1antibody 工作液。4 Streptavidin-HRP ：1100 用 Dilution buffer R(1)稀释，混匀制成 1HRP 工作液。- 6 -5. Washing buffer(50)：1 50 用蒸馏水稀释。6. 即用型溶液 Dilution buffer R(1): 用于稀释 Biotinylated antibody、 Streptavidin-HRP 和 Cytokine standard。 TMB Stop solution - 7 -7、操作过程：1. 使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。2. 根据
10、实验孔（空白和标准品）数量，确定所需的板条数目。样品（含标准品）和空白都应做复孔。3. 加样：100l/well 加入稀释后的 Cytokine standard 至标准品孔，100l/well 加入样品至样品孔，100l/well 加 Dilution buffer R (1)入空白对照孔。盖上封板膜，室温（18-25 ）孵育 1hr。4. 洗板：扣去孔内液体，300l/well 加入 1washing buffer；停留1min 后弃去孔内液体。重复 3 次，每一次在滤纸上扣干。5. 加检测抗体：100l/well 加入稀释后的 Biotinylated antibody。盖上封板膜，室温
11、（18-25）孵育 1hr。6. 洗板：重复步骤 4。7. 加酶：100l/well 加入 Streptavidin-HRP。盖上封板膜，室温（18-25）孵育 20min。8. 洗板：重复步骤 4。9. 显色：100ul/well 加入 TMB，室温（ 18-25）避光温育 5-30min 之间，根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反应。通常显色在 10-20min 可以达到很好的效果 。- 8 -10. 终止反应：迅速 100l/well 加入 Stop solution 终止反应。11. 读板：终止后 10 分钟内，用检测波长（measurement wavelength）450nm
12、读值。推荐用双波长即检测波长（measurement wavelength）450nm、参考波长或校正波长（reference wavelength）610-630nm 同时读板，测量结果会更准确。- 9 -8、 结果分析：1. 有两种设定空白对照的方案：1) 将 TMB 空白显色孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去空白孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。2) 将零孔设为对照。得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。2. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。若样品 OD 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度
13、时应乘以稀释倍数。9、试剂盒的保存：4C 可稳定保存 6 个月。00.511.520 1000 2000 3000 4000 5000Human Perferin Concentration(pg/mL)Absorption 450nm注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线来计算标本含量。- 10 -10、操作步骤一览表：加样品或配好的标准品，设置对照，100l/well加生物素标记的抗体，100l/well加亲和素-HRP 标记物， 100l/well加 TMB 显色液，100 l/well加 Stop solution 100l/well，终止反应在 450nm 处读取吸光值室
14、温孵育 1hr；洗 3 次室温孵育20min；洗 3 次室温避光 10-15min10min 内读板室温孵育 1hr；洗 3 次- 11 -11、参考文献（1） Lieberman, J. (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:361.（2） Trapani, J., et al. (2002) Nat. Rev. Immunol. 2:735.- 12 -12、ELISA 测定中可能会出现的问题及解决方法问 题 可能的原因 解决方法1非常弱的结果（1）温育的时间或温度不够；（2）显色反应时间太短；（3）所用配制缓冲液的蒸馏水有问题；（4）加入抗体/酶的稀释液浓度太低；（5）
15、酶标仪滤光片不正确；（6）不正确的试剂储存方式；（7）试剂盒没有充分平衡；（8）移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁。a. 校正温育箱温度；b. 校正定时钟准确定时；c. 使用新鲜合格的蒸馏水；d. 按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液；e. 试剂室温平衡至少 20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约 25）；f. 校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，最好一次性使用。- 13 -2标准曲线和测定的重复性差这是典型的由测定操作引起的问题，包括（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；（2）加样过快，孔间发生污染；（3）加错样本；（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；（5）不同批号试剂盒中组分混用；（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；（7）孔内污染杂物；（8）酶标仪滤光片不正确
