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1、1套层细胞淋巴瘤细胞系中染色体 13q31q32上miR1792基因簇的 DNA 序列研究作者：徐卫，李建勇，沈秋丹，李丽，于慧【摘要 】 为了研究 B 细胞淋巴瘤的染色体 13q31q32 上miR1792 基因簇的特点，观察 B 细胞淋巴瘤中 miR1792 基因簇在基因组 DNA 水平上是否存在改变，及其对 miR1792 基因簇的表达和与淋巴瘤发生关系的影响。应用 PCR 和 DNA 序列测定技术检测 Rec1、G519 和 Z138 三个套细胞淋巴瘤（ mantel cell lymphoma，MCL ）细胞系中染色体 13q31q32 上 miR1792基因簇。结果表明，3 个 M
2、CL 细胞系的 miR1792 基因簇 DNA序列与正常人的序列比对完全一致。由此可以认为，MCL 细胞系中miR1792 基因簇在 DNA 序列上没有异常改变，不是miR1792 基因簇的过度表达原因。 【关键词】 淋巴瘤DNA Sequencing of miR1792 Cluster at Chromosome 13q31q32 in Mantel Cell Lymphoma Cell LinesAbstract This study was aimed to explore the 2characteristics of miR1792 cluster at chromosome 13
3、q31q32 in B cell malignant lymphoma and to investigate the changes of miR1792 chuster in B cell lymphoma at genome DNA level and its influeuce on expression of miR1792 cluster and relation with lymphoma occurence. PCR and DNA sequencing were used to detect miR1792 cluster at chromosome 13q31q32 in m
4、antel cell lymphoma (MCL) cell lines Rec1, G519 and Z138. The results showed that DNA sequence of miR1792 cluster at chromosome 13q31q32 in MCL cell lines were normal. It is concluded that there is no abnormal change in DNA sequence of miR1792 cluster which is not the mechanism for miR1792 cluster o
5、verexpression in mantel cell lymphoma cell lines.Key words miRNA; miR1792 cluster; lymphoma微小 RNA(miRNA)是一种大小 19-25 个核苷酸组成的单链小分子 RNA，由具有发夹结构的 70-90 个碱基的单链 RNA 前体经过切酶(Dicer)加工后生成1 。miRNA 在线虫、果蝇、小鼠和人等多个物种中被广泛发现，在人类已经发现有 300 多种 miRNA，这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。人类染色体 13q31q32 上存在 5 个 miRNA 的前体3(miR91pr
6、ecursor13 miRNA、miR18 precursor13 miRNA、miR19aprecursor13 miRNA、miR19bprecursor13 miRNA 和miR92precursor13 miRNA)和 7 个成熟 miRNA (miR17、miR91 、miR18 、miR19a 、miR20 、miR19b和 miR92)的 miR1792 基因簇，而比较基因组杂交（CGH）研究结果显示，B 细胞淋巴瘤，尤其是套层细胞淋巴瘤（mantel cell lymphoma，MCL ） （包括 MCL 细胞系 Rec1）染色体13q31q32 区域有扩增2 。为进一步了解其
7、在 DNA 序列上miR1792 基因簇的改变，我们应用 PCR 和 DNA 序列测定技术对 3 个 MCL 细胞系中染色体 13q31q32 上 miR1792 基因簇进行研究。材料和方法细胞系MCL 细胞系 Rec1、G519 和 Z138，均由英国 Leicester 大学Martin Dyer 教授惠赠。此 3 种细胞基金项目：“江苏省医学领军人才”项目资助和江苏省自然基金资助项目，编号 BK20072494通讯作者：李建勇，主任、主任医师. 电话：（025 ）83718836-6550.传真：（025）83718836-6260. Email: 2007-03-26 收稿；2007-
8、07-12 接受系均存在 t(11;14)(q13;q32)异常。Rec1 细胞的核型 43,XY,del(2)(q14q35), der(7)dup(7)(p22)inv(7)(p12q21), t(3;8)(q24;p11),i(8)(p10),t(9;22)(p11;q11),t(9;?17)(q23;q?11),t(11;14)(q13;q32),der(12)t(8;12) (p13;q11),15,17,22,add(22)(q13)。中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)套层细胞淋巴瘤细胞系中染色体 13q31q32 上 miR1792 基因簇的
9、DNA 序列研究 G519 细胞的核型 43,XX,der(1)(14qter14q11:1p341p21: 1q101q12:12q1212q23),der(9)(9q319q34:12q2312q11:9p119qter),t(11;14)(q13; q32),12,der(13)(14q32 14q24:13q1413q10:13q1013qter),14,dic(17;18)(q10;q10),5trp(18) (q11q23),der(20)t(17?;20)(q21;p11)。Z138 细胞核型 51,XY,+der(1)t(1;15)(p11;q11), +der(7)del(7
10、) (q32),t(8;14)(q24;q32),der(11)del(11)(q14q25),t(11;14)(q13;q32)+del(12)(q22q24),+13,t(14;18) (q32;q21),i(17)(q10),+der(18)t(14;18)(q32;q21)。采用 10%胎牛血清 RPMI 1640 培养液，于 37、5% CO2 及恒定湿度条件下培养。采用 LNS 缓冲液裂解细胞，经碘酚抽提法提取 DNA。miR1792 基因簇的 PCR 扩增miR1792 基因簇全长约 737 bp，为便于 DNA 序列测序，设计两对引物进行 PCR 扩增，两 PCR 产物末端有部
11、分重叠。下列为miR1792 基因簇序列图，深色斜体为 miR1792 基因簇：第 1 对引物，上游：5TCAAAGTGCTTACAG TGCAGGT3；下游：5CCAGGCAGATTCTAC ATCGAC3。扩增产物大小为 426 bp。第 2 对引物，上游：5CTGATGGTGGCCTGC TATTT3；下6游：5ACAGTGGAAGTCGAAATCT TCAG3。扩增产物大小为496 bp。两对引物进行 PCR 扩增的反应体系为 50 l：DNA 模板 1 l，10PCR 缓冲液 5 l，25 mmol/L MgCl2 4 l，10 mmol/L dNTP 1 l，各引物（ 10 mol
12、/L）1 l，Taq DNA 聚合酶 1 U。扩增条件为：94 2 分钟；941 分钟，58 1 分钟，72 1 分钟，共 32 个循环；72 10 分钟，4保存。不加 DNA 模板为空白阴性对照，正常人胎盘组织为阳性对照。DNA 序列测定扩增后的产物采用 QIAquick Gel Extraction kit（Qiagen 公司产品）进行纯化，然后对纯化的 DNA 扩增产物进行 DNA 序列测定。结 果PCR 扩增 miR1792 基因簇MCL 细胞系 Rec1、G519 和 Z138 的 DNA 经两对引物 PCR 扩7增后分别在 426 bp 和 496 bp 处可见清晰的阳性条带（附图
13、） 。DNA 序列测定PCR 扩增产物经胶纯化后进行序列测定，序列结果进行序列比对（http: /www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）与正常人染色体13q31q32 上 miR17 簇的序列完全一致，未见异常变化，说明MCL 细胞系 Rec1、G519 和 Z138 的 DNA 序列测定 miR17 簇在基因组 DNA 水平上的没有异常改变。讨 论真核生物中存在两种非编码 RNA（noncoding RNA） ，一类为小干扰 RNA（siRNA） ，另一类为微小 RNA(miRNA)。miRNA的主要功能是调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达3 。miRNA 对
14、目标靶基因进行转录后调节，它们通过依赖于 miRNA 和靶基因的互补性的两种不同的机制反向调控靶基因的表达4，5 。miRNA 可视为潜在的原癌基因或肿瘤抑制物6，7 。在弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL） 、滤泡淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）和 MCL 等肿瘤中常有13q31q32 位点的扩增。而在这一扩增区域的唯一的基因就是一个非编码蛋白的 RNA：C13orf25，这个转录本编码了 miR17928基因簇，其中包含了 miR91、miR17 、 miR18、miR19a 、miR20 、miR19b
15、和 miR92 这 7 个miRNA2 。He 等 8运用基因芯片技术，发现前体miR1792 簇和成熟 miR1792 簇在 B 细胞淋巴瘤患者样本和细胞系中均过度表达，推测 miR1792 基因簇过度表达与淋巴瘤的发生、发展有关。ODonnell 等9 证明 ,miR1792 基因簇是一组可能的肿瘤相关的基因，发现 Myc 诱导了 miR1792 的表达，在 Myc 存在的情况下， miR1792 基因簇中的 miRNA 限制了 E2F1 的活性，通过阻断 Myc 和 E2F1 的正反馈循环削弱了 Myc对于细胞增殖的影响。miR1792 基因簇所起的作用是抑癌基因的作用，这与 He 等8人的发现是相反的。miR1792 基因簇的抑癌基因和癌基因的多重特点表明了肿瘤发生的复杂性和 miRNA 调控基因表达的复杂性。CGH 研究结果显示,B 细胞淋巴瘤，尤其是 MCL，染色体 13q31q32 区域有扩增。为进一步了解 MCL 中 miR1792 基因簇在基因组 DNA 序列上是否存在改变，从而影响 miR1792 基因簇的表达和与 MCL 发生的关系，我们应用 PCR 和 DNA 序列的测定技术对 3 个在13q31q32 位点的扩增 MCL
