《哮喘豚鼠肺组织Eotaxin基因表达与嗜酸粒细胞活化相关》由会员分享，可在线阅读，更多相关《哮喘豚鼠肺组织Eotaxin基因表达与嗜酸粒细胞活化相关（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1哮喘豚鼠肺组织 Eotaxin 基因表达与嗜酸粒细胞活化相关【关键词】 哮喘 关键词: 哮喘; 嗜酸粒细胞;嗜酸粒细胞趋化因子;嗜酸粒细胞阳离子蛋白 摘 要: 目的 探讨哮喘发病中嗜酸粒细胞趋化因子（ Eotax-in）基因表达与嗜酸粒细胞（Eos）活化的关系及糖皮质激素的作用. 方法 将豚鼠 30 只随机分为哮喘组、地塞米松治疗组及正常对照组.卵蛋白致敏及诱发哮喘;制备豚鼠肺组织病理标本，HE 染色; 免疫组织化学技术观察 Eos 阳离子蛋白（ECP ）在哮喘气道粘膜中的表达;原位分子杂交方法观察肺组织中 Eotaxin mRNA 的表达;将二者行相关性分析. 结果 与地塞米松治疗组、正常
2、对照组相比较，哮喘组豚鼠肺组织中 ECP 细胞（ 17244）mm-2 与 eotaxin mRNA（19657 ）mm-2 表达明显增强（P0.001） ，Eos 活化增多; 且二者呈正相关性（r=0.7447，P=0.0135 ）;糖皮质激素对 Eotaxin mRNA（2014）mm-2 ，ECP（2619）mm-2 表达有显著的抑制作用. 结论 哮喘豚鼠肺组织中 Eotaxin 表达增强，Eos 活化增多.糖皮质激素能抑制 Eotaxin 表达及 Eos 活化. 2Keywords:asthma;eosinophil;eotaxin;eosinophil cation protein
3、Abstract:AIM To study the relationship between gene ex-pression of eotaxin and eosinophils activating in lung tissue of asthmatic guinea pigs，and to study the essential function of corticosteroid in them.METHODS Thirty guinea pigs were divided into three groups（asthma ，dexamethasone ，nomal control）.
4、Ovalbumin（Ova）sensitized and challenged guinea pigs were used as the model of asthma.The pathologic sam-ples of lung tissue were stained with HE;the expression of ECP in asthmatic airway mucosa was observed by immuno-histochemistry（IHC） ，and the expression of eotaxin mRNA in guinea lung tissue was d
5、etected by in situ hybridization（ISH ）.The results were analysized by linear correlation.RESULTS Compared with the dexamethasone and normal control groups，ECP cells（17244）mm-2 and eotaxin mRNA（19657 ）mm-2 were expressed at high levels in lung tissue of asthmatic guinea pig，and the activated eosinoph
6、ils increased（P0.001 ）.The expression of eotaxin mRNA positively correlated with 3the expression of ECP（r=0.7447，P=0.0135 ）.Glucocorticoids prominently inhibited the expression of eotaxin mRNA（2014）mm-2 and ECP（2619）mm-2 .CONCLUSION The expression of eotax-in gene and the activated eosinophils incre
7、ased in lung tissue of asthmatic guinea pigs，while glucocorticoids could promi-nently down-regulate the expression of eotaxin gene and in-hibit eosinophils activation. 0 引言 哮喘的特征表现为嗜酸粒细胞（Eos）在支气管粘膜组织中的浸润1-3 .Eos 在活化状态下脱颗粒，释放活性蛋白，其中最主要的是 Eos 阳离子蛋白（ECP ）.Eotaxin 是一种 亚族趋化因子，是从抗原诱发哮喘豚鼠肺泡灌洗液中鉴定出的一种 Eos 趋
8、化物，被命名为 Eos 趋化因子，对 Eos 具有特异性的趋化作用，在哮喘的发病过程中能选择性地诱导和趋化 Eos 在肺组织中的募集4，5 .我们观察哮喘豚鼠肺组织中 Eotaxin 基因与 ECP 阳性表达，探讨哮喘发病中 Eotaxin 基因表达与 Eos 活化的关系及其对 Eos 选择性的趋化作用. 1 材料和方法 41.1 材料 健康豚鼠 30 只，由第一军医大学实验动物中心提供. 雌雄不拘，体质量 250350g ，随机分为 哮喘模型组（n=10）;地塞米松（DXM）治疗组（n=10 ）;正常对照组（n=10）.卵蛋白（Ova）:Sigma 公司;ECP mAb EG2:Pharma
9、cia公司;SABC 免疫组化试剂盒: 武汉 Boster 公司;Eotaxin 寡核苷酸探针序列:5CAG TCG CTG AAA GGA GAT CTT CTT ATT GGT CAC ACG AAA GCA GCA GGC AC3，根据 Genebank 中登录的Eotaxin（Accession U18941） ，由 Oligo5 软件设计，大连TaKaRa 公司合成并在 5末端用地高辛标记;敏感性加强型原位杂交检测试剂盒 II:武汉 Boster 公司; 图像分析仪:Photodetecter ARGUS50 型，滨松 Pho-tonix 公司. 1.2 方法 1.2.1 建立哮喘动
10、物模型 将哮喘组、DXM 治疗组豚鼠腹腔内均注入 100gL-1 Ova1mL，致敏，制备豚鼠哮喘动物模型，对照组腹腔内注入等量生理盐水.哮喘组致敏后 14d，吸入雾化的 10gL-1 Ova 诱喘，1 次d-1 ，连续5d.DXM 治疗组每次诱发前 2h 腹腔内注入地塞米松0.5mgkg -1 ，余同哮喘组.对照组豚鼠每日给予生理盐水雾化吸入 1 次，吸入时间为同批哮喘组诱喘的最长时间.实验豚鼠给予53.5mLkg-1 水合氯醛腹腔麻醉后，剖开胸腔，切开左心房，将穿刺针刺入右心室及肺动脉干，固定后快速滴入 4生理盐水 100mL 冲洗干净血液，取 40gL-1 多聚甲醛500mL，快速滴注
11、100mL，剩余液体缓慢滴注至肺组织完全变白为止. 取出肺组织，用灭菌手术刀将肺组织按与气道横断面垂直方向修剪成 12mm 厚度的组织片，放置于 4的 40gL-1 多聚甲醛中继续固定 1224h 后，进行脱水、透明、包埋、切片及HE 染色. 1.2.2 检测 ECP 阳性表达 免疫组织化学参照武汉 Boster 公司 SABC 免疫组化试剂盒说明书.切片脱蜡至水，以30mLL-1 H2 O2 ，室温处理 510min ，双蒸水洗 3 次2min，滴加复合消化液 510min ，双蒸水洗 3 次2min，滴加正常血清封闭液，室温处理 510min ，甩去多余液体，不洗，滴加 1200 小鼠抗
12、EG，2424h，阴性对照以 PBS 替代mAb，0.01molL-1 PBS 洗 2min3 次，滴加生物素化山羊抗小鼠/兔 IgG，203720/30min，0.01molL-1 PBS 洗 2min3 次，滴加试剂 SABC，203720/30min，0.01molL-1 PBS 洗 5min4 次，DAB 显色，室温，镜下控制时间，0.01molL-1 PBS 洗 5min4 次，苏木素复染 1min，脱水，透明，封片，镜检，计算机图像分析测量单位面积内 ECP 阳性细胞数 . 61.2.3 检测 Eotaxin 基因阳性表达 原位分子杂交参照武汉Boster 公司敏感性加强型原位杂交
13、检测试剂盒 II 说明书.灌注后的肺组织及时予以固定.固定液为 40gL-1 多聚甲醛/0.1molL-1 PBS，含有 1mLL-1 DEPC.标本较大时用刀片切开.固定不超过 24h.常规脱水、浸蜡、包埋.切片厚度57m. 采用多聚赖氨酸或 APES 与多聚赖氨酸处理玻片.石蜡切片经常规脱蜡至水.30mLL-1 H2 O2 室温处理 10min 以灭活内源性过氧化物酶.切片上滴加 30mLL-1 柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（30mLL-1 柠檬酸 1mL 加两滴浓缩型胃蛋白酶，混匀） ，37消化 530min，暴露 mRNA 核酸片段.0.5molL-1 TBS 洗 5min3 次 .蒸馏水
14、洗 1 次.预杂交:每张切片加 20L 预杂交液，恒温箱 3740预杂交 2h.不洗.杂交:按每张切片加 20L 含地高辛标记探针的原位杂交液.将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上.恒温水浴箱 3740 杂交过夜. 杂交后洗涤: 揭掉盖玻片， 3037左右水温的 2SSC 洗涤5min3 次;3037 左右水温的 0.2SSC 洗涤 10min1 次.滴加封闭液:室温 20min，不洗.滴加兔抗地高辛 :3760min.0.5molL-1 TBS 洗 2min3 次.滴加生物素化羊抗兔 IgG:3730min.0.5molL-1 TBS 洗 2min3 次.滴加SABC-AP:373
15、0min.0.5molL-1 TBS 洗 5min4 次.DAB 显色，苏木素复染，水性封片剂封片.计算机图像分析测量单位面积内 Eotaxin 阳性细胞数. 7统计学处理: 采用 SPSS8.0 统计软件行 t 检验和方差分析.两因素之间的相关性分析，采用直线相关分析.P0.05 为显著性差异. 2 结果 2.1 哮喘豚鼠气道的组织病理学 哮喘组气道粘膜水肿明显，表现为粘膜上皮细胞肿胀，核被挤压至细胞边缘，部分上皮细胞呈空泡样变性、坏死、脱失，杯状细胞增多.支气管管腔缩小，甚至完全闭塞，部分可见粘液栓.气道周围血管扩张充血，气道粘膜层、粘膜下层及血管周围组织有大量的炎症细胞浸润，主要以 Eo
16、s、单核细胞及淋巴细胞为主，粘膜基底层增厚.正常对照组气道粘膜无明显水肿，支气管管腔光滑，无闭塞，气道及血管周围未见炎症细胞浸润.DXM 治疗组有轻度炎症变化，较哮喘组明显减轻（Fig14）. 2.2 ECP 阳性细胞 哮喘组可见细支气管粘膜下层、肌层有大量的棕黄色颗粒围绕水肿闭塞的气道管腔，呈环形排列.肺小血管及肺泡周围组织可见较多的胞质呈棕黄色的 EG2+ 阳性细胞.DXM 治疗组及正常对照组细支气管管腔光滑，粘膜下及肌层未见棕黄色阳性颗粒分布.肺小血管及肺泡周围组织偶可见阳性细胞（Fig57）.计算机图像分析结果显示 EG2+ 细胞数mm-2 （x s）:哮8喘组（17244） ，地塞米松组（ 2619） ，正常对照组（ 137）.哮喘组与地塞米松组、正常对照组相比较有显著性差异（P0.001 ） ，地塞米松组与正常对照组之间无明显统
