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1、 广州医学院硕士学位论文NRG1-ErbB4信号在Fmr1基因敲除鼠脑组织中的改变及意义The changes and significances of NRG1-ErbB4signal in brain tissues of Fmr1 knockout mice专业：神经病学研究生：卢韬导师：易咏红教授广州医学院广州2012 年 6月 目录中文摘要. 1英文摘要. 4前言. 7材料与方法. 10实验结果. 20讨论. 29结论. 33参考文献. 34附图. 38缩略词表. 43综述. 44致谢. 52学位论文原创性声明. 53 广州医学院硕士学位论文 NRG1-ErbB4信号在 Fmr1基因
2、敲除鼠 脑组织中的改变及意义NRG1-ErbB4信号在Fmr1基因敲除鼠脑组织中的改变及意义研究生：卢韬导师：易咏红教授广州医学院神经科学研究所广州医学院第二附属医院广州市昌岗东路250号（510260）中文摘要脆性X综合征（fragile X syndrome，FXS ）是常见的遗传性智力低下性疾病之一，其发病率男性约为 1/4000，女性约为 1/8000。其根本病因是脆性 X 智障基因（fragile X mental retardation 1，FMR1） 5端非编码区（CGG）n三核苷酸重复，序列不稳定扩增及其相邻部位CpG岛异常甲基化，使 Fmr1基因失活，导致其编码的产物-脆性X
3、 智力低下相关蛋白（ fragile X mental retardation protein，FMRP）表达减少或缺失。临床上主要表现为程度不等的智力障碍、注意力缺陷、孤独症及活动过度等，此外有报道 20%-25%的 FXS 患者并发癫痫。脆性 X 综合征的模型小鼠Fmr1基因敲除（knockout，KO）小鼠的许多行为学表现与脆性X综合征患者非常相似，包括癫痫易感性。除听源性惊厥易感性增加外，我们课题组前期研究还发现Fmr1KO鼠较野生（wildtype，WT ）小鼠具有更高的热性惊厥易感性。有研究表明抑制性中间神经元功能降低可导致大脑皮层兴奋性增加，从而导致 FXS癫痫的发生。我们课题组
4、前期研究的结果也支持中间神经元的异常参与了FXS发病机制：与WT小鼠相比，KO小鼠脑组织中小白蛋白parvalbumin, PV)及谷氨酸脱羧酶（glutamatedecarboxylase, GAD）神经元数量减少；海马抑制性中间神经元上型电压门控性钠通道（Sodium channel,voltage-gated,alpha1, Nav1.1）电流密度降低。我们课题组还发现 2周龄 Fmr1KO小鼠纹状皮质、颞听皮质、梨状皮质的 PV细胞面积较同龄WT小鼠缩小。4周龄Fmr1KO与WT 小鼠比较，相应的CA2 、CA3、颞听皮质以及梨1 广州医学院硕士学位论文 NRG1-ErbB4信号在 F
5、mr1基因敲除鼠 脑组织中的改变及意义状皮质的PV细胞面积较同龄WT小鼠减小。而我们课题组也发现14-17天龄的Fmr1KO小鼠GABAAR5蛋白的的表达以及在mRNA水平均低于WT小鼠。目前大量研究表明,神经调节蛋白1（Neuregulin1）及其受体ErbB4在神经元发育、突触功能及可塑性、神经递质的传递、以及N-甲基D-天冬氨酸的调节，GABAA受体、乙酰胆碱受体亚基的表达以及在维持神经环路的平衡中起着至关重要的作用。因此本课题组提出假设：KO小鼠中 NRG1-ErbB4信号的改变有可能是导致 PV阳性中间神经元数量减少及结构改变的原因之一。本研究通过比较不同年龄组 Fmr1 KO鼠和
6、WT鼠脑组织中 NRG1和 ErbB4蛋白表达量，以及 NRG1和 ErbB4阳性神经元数量的差异，并观察比较 PV阳性中间神经元上ErbB4分布的变化，探讨NRG1-ErbB4信号在FXS中癫痫易感性增高中的作用。材料与方法：FVB品系小鼠在1921自然光的条件下饲养，让 它们自由获取食物和水分。实验前取其尾巴提取DNA，PCR技术鉴定小鼠基因型。随机选取出生后2周、4周雄性Fmr1 基因敲除（knockout mouse，KO小鼠，KO 和KO）用免疫组化法检测NRG12w 4w和ErbB4神经元数量（每组各取6只同窝小鼠）；蛋白印迹法 检测NRG1和ErbB4 蛋白含量（每组各取3只同窝
7、小鼠）；免疫荧光双标记法检测ErbB4蛋白在PV 阳性中间神经元上的表达（每组各取3只同窝小鼠）。上述所有实验都以同龄的雄性野生型（wild type，WT）小鼠作为对照组。结果：1. KO与WT小鼠脑组织NRG1阳性神经元数量的比较KO和 KO小鼠大脑皮质、海马 CA1及 CA3区 NRG1阳性神经元的数量均较同龄2w 4wWT小鼠减少，差异有统计学意义；而在齿状回区，KO和 KO小鼠NRG1阳性神经元2w 4w均较同龄WT小鼠增加，差异有统计学意义。2. KO与WT小鼠脑组织ErbB4阳性神经元数量的比较KO2w小鼠大脑皮质、海马CA1区、CA3区及齿状回区ErbB4 阳性神经元的数量均小
8、鼠减少，差异有统计学意义；KO小鼠大脑皮质、海马CA3区ErbB4阳性神经元的数量均较WT小鼠减少，差异有统计学意义，而海马CA1 区及齿状回区与WT较WT2w4w4w 4w小鼠相比差异无统计学意义。3. KO与WT小鼠大脑皮质、海马组织中NRG1、ErbB4蛋白表达量的比较2 广州医学院硕士学位论文 NRG1-ErbB4信号在 Fmr1基因敲除鼠 脑组织中的改变及意义KO2w和 KO 4w小鼠大脑皮质 NRG1、ErbB4含量分别较 WT和 WT小鼠减少，差异有2w 4w和 KO小鼠海马中 NRG1、ErbB4含量分别较 WT统计学意义；KO 2w 4w 和 WT小鼠减少，2w 4w差异有统
9、计学意义。4. KO与WT小鼠脑组织PV阳性神经元ErbB4表达量的比 较和 KO小鼠皮质、海马 CA1及 CA3区 PV与 ErbB4 共标记的神经元上，共定位阳性神经元均较 WT和 WT 小鼠减少，差异有统计学意义；而海马齿状回区 PV与KO2w 4w2w 4wErbB4共表达的神经元与同龄小鼠相比差异无统计 学意义。结论：KO和 KO小鼠大脑皮质及海马 NRG1、ErbB4阳性神 经元数量、NRG1、ErbB4 表2w 4w达量以及PV阳性神经元ErbB4表达量均减少，提示 NRG1-ErbB4信号的降低可能与KO小鼠PV阳性GABA 能中 间神经元的减少有关，可能在FXS 癫痫易感性增
10、高中发挥重要作用。【关键词】脆性X综合征；抑制性中间神经元；脑组织 ；神经调节蛋白1；ErbB43 广州医学院硕士学位论文 NRG1-ErbB4信号在 Fmr1基因敲除鼠 脑组织中的改变及意义The changes and significances of NRG1-ErbB4signal in brain tissues of Fmr1 knockout micePostgraduate: TAO LU Advisor: Prof. Yonghong Yi AbstractThe fragile X syndrome is the most frequent form of inherited mental retardation inhumans, with an incidence of 1 in 4000 males and 1 in 8000 females.The molecular basisfor this disease is the unstable amplified of a triplet repeat (CGG),in the 5 untranslatedregion and abnormal methylation of cyt
