《WAVE公司一次性生物反应器从25升》由会员分享，可在线阅读，更多相关《WAVE公司一次性生物反应器从25升（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一次性生物反应器从 25 升 -500 升的可扩展性：技术回顾摘要： 说到生物反应器，大家都有一定的了解，不过对于一次性的生物反应器，就可能知之甚少了。本文总结了 Wave Biotech, LLC 所生产的一次性生物反应器以灌流方式从 25升 工作体积放大至 500 升 工作体积的生产放大结果。实验表明三个不同体积的生物反应器是相当的。（ GE Healthcare 供稿，生物通翻译）作者： LEIGH N. PIERCE & PAUL W. SHABRAMLeigh N. Pierce ( )是美国加利福尼亚州圣迭戈 Arizeke 制药公司细胞培养与开发部经理； Paul W. Sha
2、bram 是负责工艺开发与制造的副总裁。一次性使用的组件为生物制品的生产带来了很多优势。它们干净、买来即用、不需要灭菌，因此也就减少了如冲洗用水系统（ WFI）和蒸汽发生器检修的需求。一次性的组件不能用于后续的操作，消除了工艺流程运行之间交叉污染的可能性。因为减少或摈弃了对不锈钢设备的需求，也可以避免了设备组装的长周期。系统的复杂度降低，因而所涉及的工程需求也同样减少。再也无需在位清洗（ CIP）或在位灭菌（ SIP）操作，以及相关的管道、阀门、控制器或容器的压力等级。此外，一次性组件的使用还降低了验证的复杂度。因为几乎没有可反复使用的组件，也就没有什么项目需要跟踪，也就节省了大量的灭菌、清洁
3、验证研究。最后，通过消除了坚固的管道系统和固定发酵罐的限制，一次性组件还有利于实现更快速的改装以便用于新流程的运行。一次性组件的使用可在劳力、 设备、 厂房设计以及验证方面实实在在地节省可观的费用。一次性的组件包括：生物处理袋、管、囊式过滤器、切向流舱、生物反应器、层析舱及混合系统 2。一次性生物反应器的使用及放大在某些应用中，灌流式细胞培养比分批和补料分批工艺更具优势。操作方式的选择是根据工艺规程所指定的综合需求。工艺的优化常常是评估哪种类型生产最有效的唯一途径。 分批是最常用的以终点为依据的生产方式。 在分批生产方式中， 生物反应器在接种、培养并达到指定的细胞密度和产品浓度的时即收集细胞上
4、清。在补料分批工艺中，在生产流程的晚期进行补加原料以改进细胞活力，增加总的产率。在灌流方式中，原料溶液持续加入生物反应器中，用过的培养基也不断排出。以灌流方式来运行工艺能增加培养的持久性和细胞密度，反过来又增加了整体的生产率 3,4,9 。我们的目的蛋白， AZ-IL2B ，是一个二聚体融合蛋白，由人 IL-2 连接人免疫球蛋白特异针对 pIgR 的 scFv 区域而组成 6。这个融合蛋白最适合灌流方式的生产。细胞产生的蛋白水平较低，而且 AZ-IL2B 很脆弱，特别是在 37o C。灌流生产所带来的生产容量增加，以及缩短了不稳定蛋白在反应器中停留的时间，都有助于实现更高的产量。本文总结了 W
5、ave Biotech, LLC 所生产的一次性生物反应器以灌流方式从 25 升 工作体积放大至 500 升 工作体积的生产放大结果。 我们将比较 25 升、 100 升和 500 升 工作体积的三个不同系统。对于每个生物反应器的运行都测定了以下参数，包括：细胞数量和活力、产生的蛋白数量、葡萄糖和乳酸水平。对每个系统间的这些参数进行了比较，结果显示三个不同体积的生物反应器是相当的。材料与方法生物反应器描述每个生物反应器由一个灵活的、一次性的、预先灭菌的塑料袋组成，这个塑料袋称为细胞袋 (Cellbag?) 。在操作中，细胞袋放置在摇摆平台上，充入部分培养基（图 1）。细胞袋的剩余体积则充入了由
6、二氧化碳（ CO2）和氧气（ O2）组成的气体混合物。这些气体是通过预留在细胞袋上的无菌过滤入口来添加的。空气流提供了氧气，以及控制 pH和去除二氧化碳所需的气体交换。废气则通过另一个无菌过滤器和背压控制阀排出。背压控制阀确保了细胞袋在任何空气流下总是充满的。阀门也防止了细胞袋的过度膨胀以及爆炸的可能。填充空气的顶部空间占据了细胞袋被填满时的一半体积。例如，一个充满时是 50 升总体积的细胞袋将包含 25 升 细胞悬液和 25 升 空气。空气在培养时持续地穿过顶部空间。流程中的气体，如 CO2和 O2，以可控的方式与空气混合。液体混匀以及气体的物质传递是通过来回摇动细胞袋而实现的。这种摇动在气
7、相和液相对分界面产生了波动。这些波动大大增加表面积，能提高气体转移。波浪运动还促进细胞和颗粒离开底部悬浮（防止沉降）以及大面积混匀，同时不会给细胞带来任何伤害。摇动可以通过设定摇摆角度和每分钟的摇动次数来控制。这些参数必须根据细胞袋中的使用体积来确定。细胞袋的温度可通过加热器来控制，此加热器位于设备的底盘，对细胞袋的底部进行加热。加热器是由同样位于单元的底盘的非插入式的温度传感器来调节 8。图 1. 波浪生物反应器。 20/50EH 系统。另外还设计了特别的接口，以供无菌加料及样品的取出，而无需将生物反应器置于层流柜中。可用无菌的管道连接器将培养基、缓冲液和葡萄糖储存液加入系统中。使用的生物反
8、应器分别为 20/50EH 系统、 200 系统和 1000 系统（ Wave Biotech, LLC ）。细胞解冻与增殖我们使用了 P6A2细胞系，它是一种基于 CHO的悬浮克隆，选择这个细胞株的原因在于其蛋白生产及生长特性俱佳。细胞在 120 毫升过滤的培养基中解冻，并放置在 150 毫升的转瓶内。细胞在转瓶内扩增，直到有足够的细胞来接种更大的转瓶，一直至 6 升。一旦培养物充分扩增，即被转移到细胞袋中接种。转瓶内的细胞密度维持在约 2 105 细胞 / 毫升。用于扩增的培养基是带有添加剂的无血清的 IS CHO-V (Irvine Scientific) 。我们使用了血球计数器来计算细
9、胞数量，并利用台盼蓝染料排除分析来确定细胞活力。利用 Bioprofile? 300A (Nova Biomedical) 来分析细胞培养试剂。 pH值是通过细胞袋探头进行在线测定，或用 PHM220 pH计 (Meter Lab) 来离线测定。氧气、二氧化碳、温度、摇速及摇摆角度是由 Wave Bioreactor 的控制器来测定并控制的。细胞袋接种细胞一般以 1 105- 4 10 5 细胞 / 毫升的密度接种在细胞袋生物反应器中。 我们曾以更低的密度（如 6 104 细胞 / 毫升）接种细胞，对细胞生长或生产也没有不良影响。一旦细胞在转瓶中充分扩增，就进行细胞袋生物反应器的接种。这可将转
10、瓶的内容物直接转移到生物反应器内。在此时，生物反应器已经充满了二氧化碳和氧气，并包含温暖的培养基 (37 C) 。细胞悬浮液由无菌接管连接到细胞袋，然后通过无菌的端口泵入生物反应器中。生物反应器里的增殖细胞袋中的细胞能达到比转瓶更高的密度。这最有可能是由于细胞袋内溶氧的增加，以及控制 pH的能力。在转瓶中，密度维持在 2 10 5- 6 105 细胞 / 毫升，加入细胞袋后，细胞的密度增加至 8 10 5-1 10 6 细胞 / 毫升，直到在灌流开始后， P6A2细胞克隆的密度可高达 3 10 7 细胞 / 毫升。灌流一旦细胞达到 1 106- 2 106 细胞 / 毫升，即可开始灌流。收集用
11、过的培养基，同时以相同速率向生物反应器中加入新鲜的培养基、养分、调控 pH的缓冲液。这是由生物反应器的以重量为基础的灌流控制器来直接控制的。在这个细胞密度下每天的体积交换约为总体积的 70-75%。只要细胞活力高于 50%，反应器就持续灌流。一旦细胞密度达到约2 10 7 细胞 / 毫升， 控制乳酸及其他毒副产物的累积就变得更加困难， 反过来导致 pH 的控制也非常困难。 到此阶段， 要移除部分细胞从而维持密度在 1 107- 2 10 7 细胞 / 毫升。每天的体积交换提高至约 100%，包括培养基、缓冲液及其他添加剂。利用孔径为 0.2 微米的中空纤维微孔过滤柱来灌流细胞培养上清。通过 E
12、LISA 和 Western Blot 进行蛋白分析AZ-IL2B 目标蛋白的定量是通过 ELISA 进行的。细胞培养上清是以一种专用于检测和定量 AZ-IL2B 嵌合体的方法来分析的。细胞培养上清中的 AZ-IL2B 通过与包被 pIgR 区域特异性抗体的微滴定板的结合而被捕获，捕获的 AZ-IL2B 通过生物素标记的山羊抗人IL-2 多克隆抗体 （ R&D Systems, Inc. ） 来检测。 链亲和素 -HRP结合物 （ BD Biosciences, Pharmingen ）加入最后的检测步骤中。 TMB底物溶液加入反应中，与反应中存在的酶直接反映并产生颜色变化，这种颜色变化与样品
13、中 AZ-IL2B 的量成正比。利用 AZ-IL2B 标准曲线和质量对照来测定细胞培养上清样品中 AZ-IL2B 的量。根据标准的步骤来进行 western blot 分析 7。蛋白通过 8-16%的 Tris- 甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳进行大小分离， 并转移到硝酸纤维素膜上。 膜与一抗兔抗人白介素 -2 的多克隆抗体 （ Chemicon International, Inc. ） 及二抗碱性磷酸酶结合的驴抗兔 IgG抗体（ Pierce Biotechnology, Inc. ）一起孵育。点击了解一次性生物反应器的更多信息！结果生物反应器运行 WVA、 WVB和 WVC分别指的是 Wave
14、 Biotech? 的生物反应器 20/50EH 系统、200 系统和 1000 系统。细胞计数与活力图 2 显示了每种生物反应器的细胞生长和密度相当。生物反应器运行 WVB没有达到 WVA和 WVC那么高的细胞密度，但是确实达到了 1.2 10 7 细胞 / 毫升。这是由于在第 8 天加入了高浓度的葡萄糖后导致的葡萄糖峰（图 3）。在运行生物反应器 WVA后，我们发现现有的培养基配方和投料策略无法支持超过 2 107细胞 / 毫升以上的细胞密度。 在细胞密度达到 3 107 细胞 / 毫升后， WVA的培养物的细胞活力和细胞生长显著下降，并无法恢复，这可能是由于缺乏营养物，以及毒性物质的积累
15、，包括培养物中的高水平乳酸（图 3） 5。氧合不是一个问题，因为我们能调节向培养物中添加的氧气量。每个反应器运行中的溶氧维持在 73-100%。图 2. 每天活细胞密度的比较。生物反应器运行 WVA、 WVB和 WVC的细胞密度比较。 WVA的灌流在第 13 天开始。 WVB和 WVC的灌流在第 8 天开始。图 3. 每天葡萄糖和乳酸水平的化学分析。 WVA、 WVB和 WVC生物反应器运行的葡萄糖和乳酸水平。对于随后的反应器，在细胞密度达到 1.5 10 7 细胞 / 毫升或更高，乳酸水平达 2.2 克 /升或更高时就将部分细胞除去。通过去除细胞和调整每天的灌流量，生物反应器运行被延长，收获
16、了更多的蛋白。 WVA需要更长时间才到达灌流密度（ 1.2 10 6 细胞 / 毫升），这可能是由于第 6 天温度意外降至 25 C。 WVA灌流持续了 13 天，平均产量为 12.5 毫克 / 升，而 WVB灌流持续了 18 天，平均为 8.3 毫克 / 升，比 WVA多了 5 天，收获蛋白也多了 6.7 克。 WVC灌流了 16 天，平均产量为 12.2 毫克 / 升，比 WVA多了 3 天，收获蛋白也增加了 16.4 克。活力的增加及生物反应器运行的延长都能使产量更高。蛋白产量图 4 比较了每个运行的蛋白浓度。 WVA的蛋白浓度（ 37.5 毫克 / 升）比 WVB（ 15.46 毫克 / 升）或 WVC（ 27.91 毫克 / 升）更高，这是由于更高的细胞密度。每个反应器的整体蛋白产量如下： WVA 7.8 克， WVB 21.4 克， WVC 149.2克。蛋白产量与细胞密度紧密关联。这个解释是合理的，因为存在更多的细
