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1、CaCl2 法制备感受态细胞1） 从新划线的平皿上挑取一个单菌落接种到 10ml 的 LB 培养基中于 37过夜培养2） 吸取 500l 上述过夜培养的新鲜菌液，接种到一个盛有 50ml LB 的锥形瓶中，在 37 ，200rpm 条件下振荡培养直至菌浓度达到 5107 个/ml，对大多数大肠杆菌菌株来说这时的 OD600 值为 0.40.5。一般从转接到达到此 OD 值约需 2.53 小时。3） 将培养液转至一灭菌并已预冷的 50ml 离心管（聚丙烯管）中于冰上放置 10min，使培养物冷却至 0。4） 然后于 4以 3000 rpm 离心 10min 沉淀细胞，小心地弃去上清液，并倒转管子
2、将残余的液体沥干。5） 将细胞悬浮在 10ml 冷的 0.1mol/lCaCl2 中，置冰上 10min。重复第 4 步操作，以沉淀菌体细胞。6） 收集菌体，加入 1.5ml 预冷的 0.1mol/lCaCl2,小心悬浮，分装于 200ul/管，若不马上进行转化，该感受态细胞可加入终浓度为 10%的灭菌甘油，置于-70 保存小刚论文：大 肠 杆 菌 BL21(DE3)感受态细胞的制备挑 取 新 鲜 的 大 肠 杆 菌 BL21(DE3)单 菌 落 接 种 于 5ml LB 培 养 基 中 ， 于 37摇床 培 养 过 夜 ； 培 养 物 按 1%接 种 量 接 种 于 100ml LB 培 养
3、 基 中 ， 37培 养 至OD600 为 0.5。 培 养 物 冰 上 放 置 10 分 钟 ， 然 后 于 4， 4000r/min 离 心 收 集 菌 体（ 无 菌 离 心 管 ） ； 将 菌 体 用 10ml 冰 冷 的 0.1M CaCl2 洗 一 次 ； 4， 4000r/min 离心 收 集 菌 体 ， 用 10ml 冰 冷 的 0.1M CaCl2 重 悬 菌 体 ， 冰 浴 30min； 4， 4000r/min 离 心 收 集 菌 体 ， 加 入 2ml 冰 冷 的 0.1M CaCl2 溶 液 ， 即 制 备 成 大 肠 杆 菌 BL21(DE3)感受 态 细 胞 。质粒
4、转化过程操作步骤 （1） 事先将恒温水浴的温度调到 42。（2） 从-70 超低温冰柜中取出一管（100L）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴 510min。（3） 加入 510 L连接好的质粒混合液（DNA 含量不超过 100ng） ，轻轻震荡后放置冰上 30min。（4） 轻轻摇匀后插入 42水浴中 2min 进行热激，然后迅速放回冰中，静置 2 min。（5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入 900L LB 培养基（不含抗生素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上 37震荡 1h。（6） 在超净工作台中取上述转化混合液 100200L，分别滴到含合适抗菌素的固体 LB平板培养皿中，并涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂） 。（7） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37恒温培养箱中 30-60min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入 37恒温培养箱过夜。（8） 在被细菌污染的桌面上喷洒 70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。（9） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。（10） 然后挑取单克隆验证。
