利用 Alcalase 蛋白酶生产牛骨水解明胶安广杰 王 璋 许时婴(江南大学食品学院 ,无锡 ,214036)摘 要 介绍了以牛骨素为原料 ,应用 Alcalase 蛋白酶制备水解明胶的工艺 ,初步探讨了酶解机理确定了最佳水解条件为 :温度 60 ℃、 pH 915、加酶量 115 %、底物浓度 410 %、水解时间 3 h ,得到产品的分子质量分布范围为 5～ 20 ku关键词 Alcalase 蛋白酶 ,水解明胶 ,牛骨素第一作者 :博士研究生收稿时间 :2003 - 11 - 04 ,改回时间 :2003 - 12 - 10牛骨中含有大量的胶原蛋白 ,可用于生产水解明胶水解明胶亦称胶原多肽 ,与明胶相比具有较强的水溶性 ,易被人体吸收 \[6 \]另外 ,它还具有较多的生理功能 ,例如抗高血压、预防与治疗骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病 ,及抗衰老、抗氧化等功能 \[1 ,2 ,7 \]因此 ,水解明胶在保健食品、化妆品等领域具有较广泛的用途目前 ,水解明胶的生产有酸法、碱法、加热法和酶法 \[518 \]等酶法以其水解条件温和 ,易控制及无污染等优点而独具优势试验中较深入地研究了 Alcalase 蛋白酶在生产畜骨水解明胶中的应用特性 ,为水解明胶的酶法生产提供理论依据。
1 实验原料与方法111 材 料脱盐牛骨 :购于河南省焦作市金箭实业有限公司Alcalase 蛋白酶 :FG 214L (NOVO Nordisk A/S 2800 Bagsvaerd) 其他试剂均为分析纯美国水解明胶样品 :collagen peptide H C Pcattle Hide , Nitta Gelatin Inc112 主要仪器Mastersizer 2000 型激光粒径分析仪 :英国Malvern 公司 ;进样器 : Hydro 2000MN (A) ;90 - 2型定时恒温磁力搅拌器 :上海沪西分析仪器厂 ;501 型超级恒温器 :上海实验仪器厂 ;320 - S pH计 :METTLER TOLEDO ;胶体磨 :廊坊机械总厂 ;高速冷冻离心机 : GL220B 型 ,上海科学仪器厂 ;高效液相色谱仪 :Waters 600 高效液相色谱 (配2487 紫外检测器和 M32 工作站 ) , 色谱柱 :TSKgel2000 SWXL 300 mm× 718 mm113 测定方法水解度 ( DH) :pH2Stat 法 \[3 \]蛋白质的水解度是指在蛋白质水解反应过程中被裂解的肽键占蛋白质总肽键的百分数。
DH = B × N b × 1α × 1MP × 1htot× 100 %式中 , B 为碱液体积 (mL) ; Nb 为碱液的摩尔浓度 ;α 为 α 2氨基的解离度 ; MP 为底物中蛋白质的总量 (g 或 kg) ; htot为底物中蛋白质肽键总数(mmol/ g) 蛋白质回收率 : 半微量凯氏定氮法实验中 ,将骨胶原蛋白及其水解产物的含氮量转换成蛋白质含量时的转换系数 F 采用 515蛋白质回收率 = 上清液含氮量水解液总含氮量 × 100 %水分含量测定 :烘箱干燥法 \[9 \]灰分测定 :干法灰化法 \[9 \]脂肪含量测定 :索氏抽提法 \[9 \]相对分子质量测定 :采用高效液相色谱法流动相 :pH 810 , 011 mol/ L 的 H3PO4 缓冲液标准品 :细胞色素 C 12400 ;牛血清白蛋白66000 ;乙醇脱氢酶 150 000 ;β 2淀粉酶 200 000 ;碳酸酐酶 29 00025食 品与发酵工业 Food and Fermentation Industries ( ) 2004 Vol. 30 No. 3(Total 195)114 实验方法原料处理 :将脱盐牛骨用温水冲洗以除去残余脂肪及杂质 ,以 1∶ 3 的料液质量比经砂轮磨粉碎后 ,再经胶体磨破碎 ,立即贮于 - 18 ℃冰柜中冷冻备用。
将解冻后的浆料置于酶反应器中 ,且调节pH及温度至所需的酶反应条件酶解过程中以 015 mol/ L NaOH平衡 pH2 实验结果及讨论211 浆料的组成 (表 1)表 1 骨浆的成分分析成 分 水 蛋白质 灰 分 脂 肪质量分数 / % 9415 410 011 015212 酶解条件的优化21211 酶添加量对胶原蛋白水解度的影响分别向浆料中添加 014 %、 017 %、 115 %、210 %蛋白质量的 Alcalase 蛋白酶酶解条件 :底物浓度 410 % ,温度 50 ℃ ,pH810 ,水解 3 h水解度变化曲线如图 1 所示实验表明 ,115 %的酶添加量可以达到较好的酶解效果 ,再高的酶添加量如 2 %并不能加速酶解进程 ,因此确定Alcalase 酶的使用添加量为 115 %图 1 不同加酶量时胶原蛋白水解进程曲线21212 pH对胶原蛋白水解度的影响对于不同的底物 Alcalase 酶的最适 pH 会有所变化试验选择 4 个 pH 值 ,即 815、 910、915、 10 进行比较 ,结果如图 2 所示实验表明 ,反应液的 pH 由 815 增至 915 时 ,Alcalase 对骨素的作用能力不断增强 ,但当 pH 增至 10 时 ,Alcalase 的作用能力有明显下降的趋势。
因此 ,pH915 更有利于酶解进行 ,更高或更低都不利于酶的作用 ,这可能与 pH 对胶原结构及带电荷情况的影响有关但由于 pH910 和 915 相差不太明显 ,因此在实际生产中为了降低含盐量及节约碱的用量亦可选用 pH910图 2 不同 pH条件下胶原蛋白水解进程曲线21213 温度对胶原蛋白水解度的影响Alcalase 蛋白酶对底物的最适作用温度一般为 50～ 60 ℃ ,本试验中选择 60、 50、 45 ℃进行比较 ,实验结果如图 3 所示由图 3 可知 ,温度升高能提高酶解效率 ,但温度过高会使酶失活加快 ,热能耗增加 ,且加速脂肪氧化等不利影响 ,故选用 60 ℃为酶解温度图 3 不同温度下胶原蛋白水解进程曲线21214 底物浓度对胶原蛋白水解度的影响由图 4 可知 ,底物的最适反应浓度为 6 %～8 % ,但由于浓度升高 ,粘度相应上升 ,使搅拌动力消耗增大 ,且打浆困难 ,所以本实验中选用的底物浓度为 4 %21215 粒径大小对胶原蛋白水解度的影响实验结果如图 5、图 6、图 7 所示均质前的颗粒平均粒径是 158113μ m ,均质后的平均粒径为 78134μ m。
粒径小的浆料能明显提高酶解效率酶法水解牛骨素是一个复相反应 ,反应速率不但与温度、 pH、酶添加量有关 ,还与底物浓度、不溶性颗粒大小有关由于骨素的溶解35研究报告2004 年第 30 卷第 3 期 (总第 195 期 ) ( )图 4 底物浓度对胶原蛋白水解速度的影响图 5 胶磨后均质前浆料的粒径分布图 6 均质后浆料的粒径分布图 7 酶作用于不同粒径浆料的水解进程变化性较差 ,酶与之反应 ,必须先与颗粒接触颗粒越小 ,比表面积越大 ,酶吸附在颗粒表面的机会越多 ,反应越快颗粒较大时 ,酶所能接触的面积较小 ,且不易接触到颗粒内部 ,造成酶解效率低因此 ,应尽量使浆料的颗粒变小 ,这可以通过高压均质实现213 产物的分子质量分布根据以上实验结果 ,利用 Alcalase 蛋白酶在 pH915、 60 ℃、 115 %加酶量、底物浓度 410 %条件下水解骨素 3 h ,所得水解明胶的水解度为9 % ,相对分子质量分布如图 8 所示 (由于水解明胶并没有球状三级结构 ,因此用凝胶过滤色谱方法测定相对分子质量分布所得结果仅供参考 ) 结果表明 ,本实验产品的相对分子质量主要集中于 5～ 20 ku ,游离氨基酸较少 ,与其他公司生产的水解明胶的相对分子质量分布相似(图 9) 。
另外 ,图 8 与图 9 相比 ,在前面有相对分子质量较大的一个小峰出现 ,可能是由于物料的颗粒较大 ,水解不完全所致图 8 Alcalase 水解产物的相对分子质量分布图 9 美国样品的相对分子质量分布214 产品的氨基酸组成分析由表 2 可以看出 ,实验所得水解明胶的氨基酸组成与文献报道的胶原的组成相似 \[4 \],甘氨酸含量最高 ,谷氨酸次之 ,脯氨酸含量为表 2 产品的氨基酸组成氨基酸名称 质量分数 / % 氨基酸名称 质量分数 / %天门氡氨酸苏氨酸丝氨酸谷氨酸甘氨酸丙氨酸缬氨酸蛋氨酸61472159419112199241051017731551169异亮氨酸亮氨酸酪氨酸苯丙氨酸赖氨酸组氨酸精氨酸脯氨酸210041972109312731990195719681128112 % ,色氨酸缺乏说明采用 Alcalase 蛋白酶较好地保留了胶原蛋白原有的氨基酸45研究报告( ) 2004 Vol. 30 No. 3(Total 195)3 结 语(1) 实验中确定了 Alcalase 蛋白酶水解畜骨胶原蛋白的酶解条件为 :温度 60 ℃、 pH915、115 %加酶量、底物浓度 410 %、水解时间 3 h。
均质会减小颗粒粒径 ,所以会提高反应效率2) 所得胶原蛋白水解产物的相对分子质量主要集中于 5～ 20 ku蛋白回收率为 95 %参 考 文 献1 Se2Kwon Kim , Yang2Tae Kim , Hee2Guk Byun et al. Iso2lation and characterization of antioxidative peptides fromgelatin hydrolysate of Alaska Pollack Skin \[J \]1 J AgricFood Chem , 2001 , 49 : 1 984～ 1 9892 Se2Kwon Kim , Hee2Guk Byun , Pyo2Jamn Park et al1 An2giotensin I convertiny enzyme inhibitory peptides purifiedfrom bovine skin gelatin hydrolysate \[J \]1 J Agric FoodChem , 2001 , 49 : 2 992～ 2 9973 Jens Aldler2Nissen1 Determination of the degree of hydrol2ysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonicacid\[J \]1 J Agric Food Chem , 1979 , 27 : 1 256～ 1 2624 Eastoe J E1 Amino acid composition of mammalian colla2gen and gelatin\[J \]1 Bioch , 1955 ,61 , 589～ 6005 张立萍 1 酶法生产水解明胶工艺研究 \[J \].化工时刊 ,1996 ,10(10) :166 王 碧 ,贾冬英 ,罗红平等 1 皮边角废料提取胶原蛋白的功能特性 \[J \]1 中国皮革 ,2002 ,31 (15) :13～167 张义军 ,康 白 ,任维栋等 1 胶原蛋白酶解物的降压作用及生物学特征 \[J \]1 潍坊医学院学报 ,2001 ,23 (4) :275～ 2778 关云山 1 酸法水解明胶的试制 \[J \]1 青海大学学报 ,2001 ,19(1) :32～ 349 杨严俊等译 1 食品分析 \[M\]1 北京 : 中国轻工业出版社 , 2002Production of 。