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1、1RNA 干扰与鼻咽癌的研究进展【摘要 】 RNA 干扰（RNAi ）是利用双链小片段 RNA 高效、特异性地降解细胞内同源 mRNA，阻断体内基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型1 。近几年， RNA 干扰研究在国内外迅速开展，并且扩大到许多方面，如抑制病毒的研究、抑制多药耐药基因的表达 、在人体寄生虫研究中的应用、基因治疗、肿瘤研究等。而鼻咽癌的发病机制与许多致病因素有关，实验研究表明 RNAi 可以通过多种途径影响鼻咽癌细胞的生长，因此 RNAi 可能为鼻咽癌治疗提供新的方法。 【关键词】 RNA 干扰 鼻咽肿瘤 小干扰 RNA1 RNAi 的基本过程和作用机制RNA 干扰(RNA in
2、terference，RNAi)是由双链 RNA (double stranded RNA，dsRNA)介导、特异性地降解相应序列的 mRNA，从而导致转录后水平的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)现象，具有高效性和高度特异性，已成为基因功能研究中的一种快速、简便的新方法。目前主要有 3 种作用机制形2式，即转录水平、翻译水平和转录后水平。其中转录后水平是RNAi 在各种生物中实现的主要方式。1.1 转录水平 其干扰机制是通过改变靶基因染色质结构，使其基因转录受限，关闭表达系统。dsRNA 被降解成 2123 个核苷酸长的小片段 RNA
3、时，这些小的 RNA 分子在细胞核内可以诱导组蛋白 H3 的基因及相应 DNA 的甲基化2 。这种序列特异性甲基化的信号与 RNA 和 DNA 结合有关。当 dsRNA 含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默，则转录不能进行。若甲基化出现在编码区，转录能进行，但在转录后水平上沉默。1.2 翻译水平 3 主要干扰机制是通过抑制相应 mRNA 的翻译，使相应的蛋白质表达受阻。其中起重要作用的是微 RNA (microRNA，miRNA)，它是由长度约 70?nt 的 RNA 形成的茎环样前体，经 Dicer 酶作用后形成长约 21 25?nt
4、 的单链 RNA，与相关蛋白结合成诱导沉默复合物4(RNAinduced silencing complex， RISC)，然后识别并结合在 mRNA 的 3末端非翻译区上，阻止核糖体与 mRNA 的结合及核糖体的移行，从而抑制翻译的进行。1.3 转录后水平 目前，转录后水平上的干扰是研究最多、最清3楚的一种机制。其作用大致可分为以下两个阶段。1.3.1 siRNA 形成阶段 外/ 内源性 dsRNA 通过 Argonaute 家族基因编码的蛋白质的识别，诱导 dsRNA 与 Dicer 结合。在 ATP 的参与下被 Dicer 酶切成 21 23?nt 长度的小干扰 RNA (small i
5、nterfering RNA， siRNA)。Billy 等5在小鼠畸胎瘤细胞 F19和 P19 的细胞质提取物中发现长 727?bp 的 dsRNA 被剪切为约 21 23?nt 片段，即 siRNA，强烈抑制了同源基因的表达。Zamore 等6报道，无活性 RISC 存在于胚胎细胞中，并以 250?ku 分子质量的前体形式存在，在 ATP 激活下加工成 100?ku 的 RISC，切割底物 mRNA。RISC 与互补的靶 mRNA 结合，在酶的催化下切割、降解，从而达到干扰基因表达的作用。1.3.2 扩增循环阶段 RNAi 的扩增循环机制即特异性 siRNA 与靶 mRNA 结合后，没有被
6、活性酶切割、降解。而是以 siRNA 中的一条链为引物，以靶 mRNA 的研究进展为模板，在 RNA 依赖的RNA 聚合酶的作用下，延伸形成新的双链 RNA，被 Dicer 内切酶或相关酶切割为新的 21 23?nt siRNA。2 RNAi 的特征2.1 高效性 7 注入细胞内的 siRNA 比细胞内的 mRNA 量要4少得多。但由于其自身的放大机制，仍可对目的基因产生有效地阻断。2.2 高特异性 由 dsRNA 降解成的小干扰 RNA，除其正义链 3端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外，其余碱基在序列识别中都是必需的，单个碱基的改变即能使 RNAi 失效，RNAi 能特异性降解 mRNA
7、，针对同源基因共有序列的 RNAi 则可使同源基因全部失活。2.3 共抑制性 RNAi 是双链 RNA 介导的转录后基因沉默机制，它的启动子相当活跃，外源基因可以转录，但不能正常积累mRNA。RNAi 作用不仅使外源基因在转录后水平上失活，同时诱导与其同源的内源基因沉默。2.4 高穿透性 RNAi 具有很强的穿透能力，能在不同的细胞间长距离传递和维持。2.5 遗传性 已在线虫中观察到 RNAi 效应通过生殖系统传递到后代，说明 RNAi 具有一定的遗传性。2.6 干扰结果出现快 RNA 干扰基因的表达发生在转录后，通过降解细胞质中同源 mRNA，阻断该基因的表达，干扰结果在短时间5内就可产生，
8、这是其他实验技术无法比拟的。2.7 双干扰系统 哺乳动物中存在有非特异性干扰和特异性干扰两条独立的途径。非特异性干扰反应是由大于碱基对(bp)的双链RNA 介导，导致整个细胞中非特异性蛋白合成抑制，RNA 降解；特异性反应由 21 25?bp 的小干扰 RNA 介导，可逃避非特异性干扰系统的监控，只降解与其序列相应的单个基因的 mRNA。2.8 RNAi 具有 ATP 依赖性 Dicer 对 dsRNA 的切割、RISC 的形成以及 RdRP 对沉默信号的扩增都需要 ATP 供能。3 RNA 干扰治疗鼻咽癌前景3.1 EB 病毒与 RNA 干扰 EB 病毒又称人类疱疹病毒 4 型，是双链 DN
9、A 病毒，人类是其唯一的天然宿主。已经被证实 EB 病毒与多种肿瘤相关，如 Burkitt 淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病、胃癌等，其中 EB 病毒与鼻咽癌的关系尤为密切。几乎世界各地所有鼻咽癌患者的癌组织中，均可检出 EB 病毒的 DNA 和 EB 病毒核抗原8(EBV nuclear antigen，EBNA)。研究发现，96 的鼻咽癌患者血浆中能够检测到 EBV DNA 的表达和 EB 病毒核抗原，鼻咽癌患者血清中含有较高滴度的 EB 病毒特异的 VCA IgA 或 EA IgA9 。EB病毒特异性抗原包括病毒潜伏感染时表达的抗原 LMP、EBNA 和病6毒增殖性感染相关的抗原(MA、EA、V
10、CA)。其中潜伏膜蛋白1(1atent membrane protein 1，LMP1)是目前已经被证实在 EBV所引发细胞癌变和癌转移过程中的致癌物质。LMP1 生物学功能主要包括下调 E钙黏蛋白表达，诱导 matrix metalloproteinases 家族基因表达10 ，激活 UK 尿激素纤溶酶，增加细胞跨膜移行能力，从而降低肿瘤细胞粘附力，降解细胞外基质和基底膜，刺激新血管增生，有助于鼻咽癌发生、生长和转移。Li 等11 用 RNAi 抑制EB 病毒 LMP1 蛋白的编码基因发现，LMP1 mRNA 水平下降 90以上，且 E钙黏蛋白 mRNA 表达增高，使鼻咽癌细胞被阻滞在细胞周
11、期的 G0 G1 期，达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。提示 RNAi 能抑制 LMP1 蛋白的表达，为鼻咽癌的治疗和预防提供新思路。3.2 鼻咽癌的原癌基因与 RNA 干扰 鼻咽癌的原癌基因编码的蛋白主要包括基因转录调节因子、生长因子及其受体、信号转导分子和调控蛋白等。这些蛋白与鼻咽癌的发生发展密切相关。研究表明，运用 RNA 干扰手段抑制鼻咽癌相关的原癌基因编码的 ras 基因、emyc 基因的活性，可成功地抑制人鼻咽癌细胞的体外增殖11 。Raf1 是致癌基因，在细胞信号转导通路“RasRaf1ERK MADK”中起中枢作用。刘立中等12构建了三个质粒，通过脂质体转染人鼻咽癌细胞株 HNE1，
12、用 RTPCR 分析 Raf1 基因的mRNA 的表达量减少，流式细胞仪检测细胞调亡率增加，达到 65%。因此，应用 RNAi 技术抑制鼻咽癌相关基因的表达，有望达到抑制7鼻咽癌细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的目的。在鼻咽癌患者中表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)表达阳性率明显高于对照组，并且肿瘤分化越差，EGFR 表达阳性率越高；鼻咽癌颈淋巴结转移者的 EGFR 表达明显高于无颈淋巴结转移者13，14 ，表明 EGFR 与鼻咽癌的发生、癌细胞分化和肿瘤进展有一定关系。并有研究表明，利用将 EGFR特异性 siRNA 转染的鼻咽癌低分
13、化细胞株 58F，通过流式细胞仪检测发现能够诱导细胞周期停止在 G1 期，降低细胞生长速度15 。提示 RNAi 能下调鼻咽癌细胞的 EGFR 表达，达到抑癌作用。3.3 凋亡抑制基因与 RNA 干扰 bclx 基因，属于 bcl2 家族的新成员。因其 mRNA 剪切方式的不同，可产生两个基因产物：长型bclxl 与短型 bc1xs。bclxl 和 bclxs 功能互为相反，前者与bc12 功能相似，能抑制多种因素诱导的细胞凋亡；后者则促进细胞凋亡。我们的研究发现，鼻咽癌细胞 bclxl 表达异常增加，而bclxs 基因不表达16 。Li 等17体外合成针对人 bcl xl 基因的 siRNA
14、，并转染鼻咽癌 CNE2Z 细胞株。分析结果为，CNE2Z 细胞中各 siRNA 转染组 bclxl mRNA 表达水平可下调10% 70%。 CNE2Z 细胞增殖抑制率和凋亡率均在一定剂量范围内随浓度的增加而增加，具有剂量依赖性。但是，将 pmU6sibclD重组质粒转染到人鼻咽癌 CNE2Z 细胞株，在转染后 12 48?h，其8重组质粒表达的短发夹状 RNA（shRNA）能使 bclxL mRNA 下降 90% 99%，同时降低 bclxL 翻译的蛋白表达水平18 。虽然两个实验研究的数据存在一定差异，但都证实了 RNA 干扰能有效地抑制 bclxL mRNA 表达，为质粒介导的 RNA
15、i 技术运用于鼻咽癌的基因治疗提供了一定的理论依据。3.4 VEGF 与 RNA 干扰 肿瘤血管形成是肿瘤生长和转移的主要因素。VEGF 作为有力的丝分裂素及血管渗透性治疗剂，其主要生物学功能有：（1）选择性地增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖并促进血管形成；（2） 升高血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外基质中，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。血液中 VEGF 水平在人类的多数肿瘤中是一种有用的预测因子。VEGF 在 67的鼻咽癌患者中过度表达，VEGF 的高表达与鼻咽癌的复发率高及患者的生存显著相关19 。近来有学者用 ELISA 法测定 VEG
16、F siRNA 转染后24?h， 36?h 对鼻咽癌细胞 CNE 细胞株(昆明细胞库提供) 内 VEGF的抑制作用20 ，结果显示，在转染后 24h 其抑制率达 40，转染后 36?h， VEGF siRNA 在鼻咽癌上皮样细胞系中几乎完全抑制VEGF 的分泌。HE 切片则表明，VEGF siRNA 组裸鼠肿瘤细胞有大面积坏死灶，癌细胞周围间质水肿明显。对照组肿瘤细胞生长良好，坏死区少见，形态正常，无塌陷。因此通过 RNA 干扰 VEGF，有可能影响鼻咽癌血管的生长和原发瘤的生长与浸润，对鼻咽癌的治疗有非常重要的意义。93.5 端粒酶与 RNA 干扰 端粒酶在肿瘤的发生发展中有重要意义。在恶性肿瘤中，端粒酶活性明显增高，以延长端粒，弥补因细胞分裂而造成的端粒缩短，从而使细胞无限增殖恶化。而端粒酶逆转录酶 hTERT 被普遍认为是端粒酶的
