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1、1LMO3 mRNA 在小鼠脑发育过程中的表达作者：惠玲，蔡文琴，纪华，吕同德，杨金升，赵治华 【关键词】 LMO3；原位杂交组织化学；小鼠；脑【Abstract】 AIM: To examine the localization of neuronal specific transcription factor LMO3 mRNA in the development of central nervous system (CNS) of the mice. METHODS: Realtime fluorescence quantitative RTPCR(FQ RTPCR) and in s
2、itu hybridization histochemical staining method with digoxinlabeled cRNA probe were used to detect the expression of LMO3 mRNA. RESULTS: The FQ RTPCR showed that the expression of LMO3 mRNA was the highest during pregnancy, then it decreased significantly after birth and almost remained the same lev
3、el until adult. LMO3 mRNA expression was extensive in brain at early embryonic stages (E10.511.5 d), but not detected at other parts of embryo. The high level in brain was still seen over mid(E15.5d) and late (E17.5P0 d) embryonic brain and showed less different signal. During postnatal development,
4、 LMO3 mRNA was found gradually regionalized and showed the difference of signal in 2different parts of brain. LMO3 mRNA expression of P14P60 d was still extensive although the extent was gradually more regional than that of P7d. The signal of LMO3 mRNA was mainly located in different nucleus clony a
5、nd showed different intensity. CONCLUSION: LMO3 plays a role in brain development during embryonic period and postnatal differentiation and specification of specific brain regions.【Keywords】 LMO3; in situ hybridization histochemistry; mice; brain【摘要】 目的： 研究不同发育时期小鼠脑内 LMO3 的表达. 方法： 采用以 SYBR Green I 为
6、荧光染料的定量 RTPCR 及以地高辛标记的 cRNA 为探针的原位杂交组织化学法检测 LMO3 基因在小鼠脑发育过程中的表达. 结果： FQ RTPCR 结果表明，LMO3 在出生前高表达，P7d 后表达水平急剧下降，至成年都维持在一个较低的水平. LMO3 mRNA 在小鼠胚胎期 E10.5d 即有表达，但仅限于整个脑泡组织内，胚体其他区域均为阴性；E11.5d 脑区信号逐渐加强，无核团及脑区的特异性，胚体其他部分仍为阴性；E15.5P0d期 LMO3 阳性信号在几乎所有观察的脑区均有广泛而较强的着色；P7d LMO3 阳性信号较出生前变弱，分布逐渐集中；P14P60d 3LMO3 mRN
7、A 表达范围较 P7d 逐渐缩小，但仍有广泛表达，阳性信号主要集中于不同核团，表达有强弱之分. 结论： LMO3 基因可能与小鼠出生前脑的发育以及出生后特定脑区神经元的特化及特性维持有关.【关键词】 LMO3；原位杂交组织化学；小鼠；脑0 引言多巴胺相关转录因子 DAT1 (GenBank 登录号： AF258348)又称 LMO3，是我们获得的星形胶质细胞在 DA 作用下发生反应性变化时上调表达的基因之一1. LMO 家族由 4 个成员组成，即LMO1LMO4. 我们以往的研究证实 LMO3 mRNA 在成年大鼠和小鼠的中枢神经系统（CNS）中分布广泛，提示 LMO3 基因在CNS 有重要作
8、用 2. 本试验采用实时荧光定量 RTPCR 方法及原位杂交组织化学的方法对 LMO3 mRNA 在小鼠脑发育过程中的表达变化进行了研究，以探讨 LMO3 在神经系统发育中的作用.1 材料和方法1.1 材料成年昆明种雌雄小鼠由本院实验动物中心提供. 于每日 18：00 按雌雄 11 合笼，次日晨取出，检查雌鼠的阴道口有无4阴栓，有阴栓者既定为孕期 0 d(E0d)，出生当日为生后 1 d(P0)，依此类推. 分别取 E10.5，E11.5, E15.5，E17.5，P0，P7，P14，P30，P60 d 的小鼠，每组 5 只，进行原位杂交检测并提取总 RNA 后用于荧光定量 RTPCR 试验.
9、 地高辛标记小鼠 LMO3 cRNA 寡聚核苷酸探针由湖北武汉博士德公司合成.1.2 方法1.2.1 荧光定量 RTPCR 采用 Tri 201 试剂提取制备总 RNA，测定 A260 nm 对 RNA 进行准确定量. 取 2 g 总 RNA，经MMLV 逆转录酶催化合成 cDNA 第一链，以此为模板进行荧光定量 PCR 扩增，荧光介质选用 SYBR Green I，根据同时扩增的标准曲线，计算出各样本的初始拷贝数，结果以 LMO3 copies/G3PDH copies 表示 LMO3 mRNA 在各组起始 RNA 中的相对含量. 在PCR 后进行融解曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，
10、温度以 0.2/s 的速率从 55缓慢递增到 100. 同时将反应产物置 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳进一步观察扩增产物的特异性.1.2.2 原位杂交组织化学全胚胎原位杂交 新鲜取材的鼠胚(E10.511.5)用 PBS 洗 2 次，入 4%多聚甲醛固定过夜，PBT 洗 2 次后，用 250 mL/L 甲醇 PBT, 500 mL/L 甲醇 PBT, 750 mL/L 甲醇5PBT, 纯甲醇 PBT 梯度脱水，(可-20储存备用，用时再用甲醇PBT 水化)，用含 60 mL/L H2O2 的 PBT 漂洗 1 h, 10 g/mL 的蛋白酶 K 消化，2 mg/mL 甘氨酸洗 2 次， 2 g
11、/L 戊二醛后固定 20 min,杂交液中 70预杂交 2 h，含 1 g/mL LMO3 探针的杂交液中过夜,溶液 洗 2 次，每次 30 min,溶液 洗 2 次，每次 10 min, 100 g/mL RNaseA 洗 2 次，每次 30 min；TBST 洗 3 次，100 mL/L 羊血清室温封闭 1 h，抗地高辛抗体 11000 孵育过夜，TBST 洗 5 次，新鲜配制的 AKP Buffer(pH 8.0)洗 3 次，NBT/BCIP暗处显色，PBT 洗 3 次，中止显色，40 g/L 多聚甲醛固定过夜，PBT 漂洗，甘油透明，4 保存. 同时设阳性及阴性对照(同切片原位杂交).
12、切片原位杂交：0.1 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗 5 min3 次，3 g/L TritonX100/PBS(RNase free)漂洗 25 min，蛋白酶 K(2 g/mL)于 37孵育 30 min，( 于 0.1 mol/L TrisHCL pH 8.0; 50 mmol/L EDTA 缓冲液中)，40 g/L 多聚甲醛中漂洗 5 min2 次，0.1 mol/L PBS(RNase free)漂洗 5 min2 次，浸入新配制的 0.1 mol/L TrisHCL (pH 8.0，含 25 g/L 乙酸酐)5 min, 2SSC 漂洗 10 min，切片在含 0.5 g/
13、mL 地高辛标记的 LMO3 cRNA 探针的杂交液中 42反应 24 h 后，20SSC 中漂洗 15 min，转入 4SSC 中漂洗 5 min，2SSC 中( 含 RNaseA 20 g/mL)漂洗 30 min(37)，1SSC，0.5SSC 中各漂洗 10 min(37) ，0.05 mol/L PBS 漂洗610 min2 次，将切片移入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体中孵育4 h(37) ，0.05 mol/L PBS 漂洗 10 min3 次，TSM1，TSM2 中各漂洗 10 min2 次，用 NBT/BCIP 显色液显色 35 h(室温) ，裱片、脱水、DPX 封片 . 阴性对
14、照将切片用 RNaseA 进行预处理后杂交，以不含探针的杂交缓冲液取代含 DigLMO3cRNA 探针的杂交液；阳性对照为以地高辛标记的 GFAP 探针代替 LMO3 探针进行杂交染色.2 结果2.1 小鼠脑不同发育时期 LMO3 mRNA 表达采用以 SYBR Green I 为荧光染料的定量 PCR，结果表明 LMO3 在 P0 d 以前高表达，出生后表达量急剧下降，至成年基本维持在一个较低的水平（图 1）. 此外，为了确定产物的特异性，我们分析了产物的融解曲线(melting curve)，LMO3 扩增产物只在 90左右出现一个高峰，GAPDH 也只在 79左右有一个高峰；并且凝胶电泳
15、的结果也显示条带单一（图 2） ，表明无非特异性扩增 .E15.5： 胚胎 15.5 d; P0, P7, P14, P30, P60：出生后 0, 7, 14, 30, 60 d.图 1 荧光定量 RTPCR 检测小鼠脑不同发育时期 LMO3 mRNA 的表达（略）7M: Marker; E15.5： 胚胎 15.5 d; P0, P7, P14, P30, P60：出生后 0, 7, 14, 30, 60 d.图 2LMO3 及 G3PGH 荧光扩增（略）2.2LMO3 mRNA 在小鼠 CNS 发育过程中表达全胚胎原位杂交及切片原位杂交可见，LMO3 阳性信号为蓝紫色，主要位于神经元的胞
16、体及突起内,但核内也可见 LMO3 染色.E10.5：LMO3 mRNA 在小鼠胚胎期 E10.5d 即有表达，阳性信号可见于端脑、间脑、中脑、后脑、末脑等脑泡，胚胎其他部位为阴性(图 3A)；E11.5 d 阳性信号加强，仍位于上述脑区(图 3B)；E15.5P0 切片原位杂交显示，LMO3 mRNA 在整个脑部切片中均有较强而广泛的分布，着色基本一致，除在 E17.5 及 P0 d 海马的颗粒层、大脑皮质、嗅球的内丛层及僧帽细胞层可见较周围组织有明显增强的染色，其他部位阳性信号无明显强弱区分.P7：LMO3 阳性信号较出生前变弱，分布逐渐集中，在少数核团可看到中等强度的着色，如在嗅内皮质（图 3B） ，海马锥体细胞层 (3C)，面神经核、舌下神经核、脊髓灰质等部位可见强的阳性信号；大脑皮质颗粒层、海马齿状回(图 3C)等部位可见到中等强度的阳性细胞，其他大部分脑区的阳性信号均较弱，但分布很广. P14P60： LMO3
