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1、1KDR siRNA 表达载体的构建和鉴定作者：缪应业，刘家云，易静，苏明权，沈建军，郝晓柯【关键词】 血管内皮生长因子受体 2Construction and identification of siRNA expression vector targeting KDR【Abstract】 AIM: To construct pSilencerTM3.1H1 small inferfering RNA （siRNA） expression vector targeting human KDR gene and to observe its silencing effect in the PC
2、3 prostate cancer cell line. METHODS: The designed oligos targeting KDR were cloned into the pSilencerTM3.1H1 neo vector, which was lineated after BamH and Hind digestion. The recombimant vectors were confirmed by enzyme digestion analysis and DNA sequencing.The recombimant vectors of pSilencer 3.1K
3、DR1, pSilencer 3.1KDR2 and pSilencer 3.1KDR3 were transfected by liposomemediated transfection into the PC3 prostate cancer cell line with high metastasis potential. At 72 h after transfection, the expression of KDR at the levels of mRNA and 2protein was detected by RTPCR and Western blotting. RESUL
4、TS: The pSilencerTM3.1H1 siRNA expression vectors were constructed and confirmed after the enzyme digestion analysis and the DNA sequencing. The siRNA expression vectors of pSilencer 3.1KDR1, pSilencer 3.1KDR2 and pSilencer 3.1KDR3,were successfully constructed.pSilencer 3.1KDR3 was most effective i
5、n the 3 which downregulated 55% mRNA and protein of KDR at 72 h after transfection. CONCLUSION: pSilencerTM3.1H1 siRNA expression vectors targeting KDR were successfully constructed. The expression of KDR gene was inhibited effectively in PC3 cells transfacted by pSilencer 3.1KDR3,which laid a basis
6、 for its application in the treatment of prostate cancer.【Keywords】 vascular endothelial growth factor receptor2; RNA, small interfering; PC3 cell line【摘要】 目的： 构建针对血管内皮生长因子受体(VEGFR2),又称激酶功能区受体（ KDR）的 pSilencerTM3.1 siRNA(small interfering RNA)表达载体，并在前列腺癌细胞 PC3中观察其干扰效果. 方法： 设计针对 KDR 基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后
7、克隆入经 BamH, Hind双酶切线性化的干扰载3体 pSilencerTM3.1H1 neo 中，对重组质粒进行酶切分析和 DNA系列测定. 以脂质体法将 pSilencerTM3.1H1 neo 空载体和 3 个(pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2 和 pSilencer3.1KDR3)重组质粒分别导人 PC3 前列腺癌细胞系. 72 h 后用 RTPCR 和Western blotting 技术检测各实验组前列腺癌细胞内 KDR mRNA及蛋白水平的表达情况. 结果： 经酶切鉴定及 DNA 测序，重组质粒中已插入了目的基因片断. 转染 KDRsiRNA
8、 的前列腺癌细胞，72 h 后，而以 pSilencer3.1KDR3 的抑制 KDR mRNA 及蛋白表达效果最为有效，其抑制率约为 55%. 结论： 成功构建了针对 KDR 的RNA 干扰表达载体 pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2 和pSilencer3.1KDR3, pSilencer3.1KDR3 能有效抑制 KDR 在前列腺癌细胞中表达，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.【关键词】 血管内皮生长因子受体 2；RNA ，小分子干扰；PC3 细胞系0 引言血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth fac
9、tor receptor, VEGFR2)，又称激酶功能区受体（kinase domain receptor, KDR)，在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表4达，对于 VEGF 的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用. 研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF 和 KDR 表达，存在 VEGFKDR 自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关1-2. RNA 干扰 (RNA interference, RNAi)是指双链 RNA 介导的、序列特异的转录后基因沉默的过程，它作为新兴的基因阻断技术,目前已广泛应用于基因功能及基因治疗的相关研究. 我们通过构建 KDR
10、 基因特异性 small interfering RNA(siRNA)表达载体，检测其对前列腺癌细胞系 PC3 中 KDR 基因的沉默作用，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.1 材料和方法1.1 材料 pSilencerTM3.1H1 neo 质粒购自美国 Ambion 公司；KDR 特异性 DNA 片断由北京赛百胜公司合成；BamH, Hind限制性内切酶，T4DNA 连接酶，DNA 酶， Taq 酶购自大连宝生物公司；去内毒素质粒提取和反转录试剂盒购自美国Promega 公司；RPMI1640 培养基、RNA 提取、Lipofectamine2000 转染试剂购自美国 Inv
11、itrogen 公司；PC3 细胞株，DH5a 菌种为本室保存；小鼠抗人 KDR 单克隆抗体购自R&D 公司；免疫印记所用二抗（羊抗鼠） 、DAB 显色液均购自武汉博士德公司；GAPDH 内参及其抗 GAPDH 单抗均购自上海康成生物有限公司；Mini2D cell 型电转印仪为 BioRAD 公司生产；5DU800 核酸蛋白分析仪为贝克曼公司产品；FR200 图像分析系统为上海复日科技公司产品；pEGFPN2 质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.1.2 方法1.2.1siRNA 靶序列的设计根据 shRNA 设计原则3 及KDR(基因号 AF063658)cDNA 序列，使用美国
12、 Ambion 公司在线设计软件设计针对 KDR 基因编码区（A： 395414；B： 29692988；C： 39063925）特异性插入片断序列共三对六条，分别命名为（pSilencer 3.1KDR1, pSilencer 3.1KDR2, pSilencer 3.1KDR3）. pSilencer 3.1KDR1：正义链为5GATCCGCATGGAGTCGTGTACATTATTCAAGAGATAATGTACACGACTCCATGTTTTTTGGAAA3；反义链为5AGCTTTTCCAAAAAACATGGAGTCGTGTACATTATCTCTTGAATAATGTACACGACTCCATG
13、CG3；pSilencer 3.1KDR2： 正义链为5GATCCGCTCCTGAAGATCTGTATATTCAAGAGATATACAGATCTTCAGGAGCTTTTTTGGAAA3；反义链为5AGCTTTTCCAAAAAAGCTCCTGAAGATCTGTATATCTCTTGAATATACAGATCTTCAGGAGCG3；pSilencer 3.1KDR3： 正义链为5GATCCGCGGCTACCAGTCCGGATATTCAAGAGATATCCGGAC6TGGTAGCCGCTTTTTTGGAAA3；反义链为5AGCTTTTCCAAAAAAGCGGCTACCAGTCCGGATATCTCTTGA
14、ATATCCGGACTGGTAGCCGCG3. 黑体部分为 KDR 基因特异性序列，序列经同源性分析后，提交公司合成. 1.2.2KDRsiRNA 表达载体的构建合成编码发夹结构 siRNA的正义链和反义链，分别取 5 L 正反义寡核苷酸(终浓度均为 25 mol/ L)， 10 L 5退火缓冲液(500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris, pH 7.6)，加入 30 L 去离子水于 95 水浴中 5 min，然后自然冷却至室温. 将退火后的双链 siRNA 模板与载体于 16 连接过夜，以连接产物转化 E.coli DH5a 感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载
15、体. 扩增白色的抗性菌落并提取质粒，以BamH, Hind双酶切鉴定重组质粒. 收集酶切鉴定正确的重组质粒，提交大连宝生物公司进行 DNA 序列测定.1.2.3 转染用质粒 DNA 的制备、纯化及定量以去内毒素质粒提取试剂盒，分别提取 pSilencerTM3.1H1 neo 空载体和KDRsiRNA 重组质粒. 经分光光度计和电泳检测，A260nm/A280 nm1.8，且无任何降解的 DNA 用于转染.1.2.4KDRsiRNA 质粒的细胞转染用去内毒素质粒提取试剂盒提取测序正确的各重组质粒和 pEGFPN2 质粒 . 将 PC3 细胞按71105/孔的数量转种于 6 孔培养板，RPMI1
16、640 培养液（含 100 mL/L 小牛血清，100 万 U/L 青霉素，100 万 U/L 链霉素） ，37, 5 mL/L CO2 培养至 80%左右，更换无抗生素、无血清的RPMI1640 培养液继续培养 6 h，分别用各重组质粒转染 PC3 细胞，使用美国 Ambion 公司提供的含有与任何已知序列不同源的shRNA 序列的质粒为阴性对照和未转染照. 每孔质粒用量为 2 g，脂质体用量为 5 L. 以 pEGFPN2 质粒同步转染检测转染效率. 转染后 6 h 更换为含 200 mL/L 小牛血清无抗生素 RPMI1640 培养液. 瞬时转染后 72 h 收获细胞检测 KDR 的表达水平.1.2.5KDRsiRNA 转染细胞 KDR mRNA 表达的 RTPCR 检测转染后 72 h，提取总 RNA 并定量，用 DNA 酶处理总 RNA 以去除 DNA 污染，各实验组取同等量的 RNA 反转录后进行 PCR. pSilencer
