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1、论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助实验方法如下:第一步：制备组织裂解物1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解 Western 及 IP 细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 PMSF,使 PMSF 的最终浓度为 1mM。 3. 按照每 20 毫克组织加入 100-200 微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后，10000-14000g 离心 3-5 分钟，取上清，即可进行
2、后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用 于后续实验。或1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解 2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80C 以备后用。 3. 每 5mg 组织加入 300ul 裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 4. 用 300ul 裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在 4C 缓慢摇动2 小时 5. 120
3、00rpm 4C.离心 20 分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀 。 裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。蛋白的合适浓度为 1-5 mg/ml ，最低不能少于 0.1 mg/ml。第二步：预纯化裂解物使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合 Ig 的蛋白去除，随后加入的 agarose beads 一方面将裂解物中非特异结合 agarose 或sepharose beads 的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景
4、更低、信噪比更好。但如果最后是使用 WB 来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。主要步骤：1. 每 1ml 裂解物加入 50ul 和 IP 抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠 IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴 1 小时 2. 加 100 l Preotein A/G agarose beads， 4C 缓慢摇动10-30 分钟 3. 14,000 x g 4C 离心 10 分钟 4. 取上清，弃沉淀 为提高蛋白回收率，可将 Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗涤 1-2
5、次，所得上清和前面的合在一起Note：要确保最大可能将正常血清（或无关 Ig）从标本中去除。第三步：免疫沉淀1. 取 10-500 g 细胞裂解物，加入推荐量的抗体：抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的亲和力。可参考说明书推荐的抗体用量，如果说明书没有推荐，也可以参考以下数据：. o 多抗血清：1-5 l o 亲和纯化的多抗：1 g o 腹水（单抗）：0.2-1 l o 培养上清（单抗）：20 -100 l 2. 4缓慢摇动孵育 1h 到过夜，取决于蛋白的量以及抗体的亲和力 3. 同时准备 Preotein A/G agarose beads。建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖
6、珠：根据抗体类型选择合适的 beads（参考附表 2），如果 IP 抗体是 IgM：不使用 protein-A/G beads，直接使用 Goat anti Mouse IgM beads。 4. 加入混匀的 70-100ul protein-A/G beads，4缓慢摇动4h（根据具体实验优化孵育时间) 5. 2500rpm(约 1000g) 4C 离心 5 分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉 Protein G Agarose。 6. 用准备蛋白样品时的裂解液洗涤沉淀 3-5 次，裂解液或 PBS 的用量每次为 0.5-1 毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要
7、求同上面的步骤 3。 7. 最后一次洗涤后，去除上清，加入 25-50ul 2电泳上样缓冲液，95-100C 煮沸 5 分钟（将蛋白变性并从 protein-A/G beads中分离下来）。离心后取上清，弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续 WB 分析或-80C 保存。 Loading buffer 是最强力的洗脱液，所以同时也会将无关的结合抗体或抗体片段洗脱下来，这些在后面电泳时会有所体现。抗原可以使用梯度甘氨酸溶液（up to 1 M）从抗体上洗脱下来。附 1：免疫沉淀中用到的主要 buffer 和试剂裂解 buffer 中各种成分的推荐浓度范围 Salts: 0-1 MDetergent,
8、 non-ionic: 0.1-2%Detergent, ionic: 0.01-0.5%Divalent cations: 0-10 mMEDTA: 0-5 mMpH: 6-91. 非变性裂解 buffer：适用于抗原类型：可溶于变性剂并且其天然状态可被抗体识别20 mM Tris HCl pH 8137 mM NaCl10% glycerol1% Nonidet P-40 (NP-40)2 mM EDTA4C 可保存 6 个月使用前加入：Protease inhibitors上述溶液中 NP-40 可使用 Triton X-100 替代2. RIPA (RadioImmunoPrecipi
9、tation Assay) buffer 含有更强的变性剂，特别适用于核蛋白的提取。50mM Tris HCl pH 8150 mM NaCl1% NP-400.5% sodium deoxycholate0.1% SDS10% sodium deoxycholate 橱窗液需要避光保存。3. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解 buffer（Detergent-free soluble protein lysis buffer）：一些可溶性蛋白不需要使用去污剂，只要使用该 buffer 配合机械性的破碎操作即可：如将细胞反复用带针头的注射器吸取或进行匀浆操作含有以下成分的 PBS：5 mM EDTA
10、0.02 % Sodium Azide4C 可保存 6 个月使用前加入：Protease inhibitors4. 变性裂解 buffer 或不溶于变性剂的抗原提取 buffer: 有些抗体只能识别变性后蛋白的表位而不识别天然状态的蛋白表位。这样就需要使用变性裂解 buffer，然后煮沸处理即可。该方法同样适用于不能用非离子去污剂提取的蛋白。在该 buffer 中加入DNase1 将有利于提取染色质蛋白1% SDS5 mM EDTA室温可保存 1 周使用前加入：Protease inhibitors、10mM DTT or beta-mercaptoethanol、15 U/ml DNase15、其它所需试剂：蛋白酶抑制剂 Protease inhibitors ：推荐使用蛋白酶抑制剂cocktail，也可使用 PMSF (50 ug/ml)和 aprotinin (1 ug/ml).无菌 PBS pH 7.4无菌 PBS-BSA 1% (过滤处理)TBST 缓冲液WB 上样 buffer
