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1、1ADM 诱导 MCF-7 耐药后细胞免疫表型的改变及临床意义【摘要 】 目的 探讨 ADM 诱导 MCF-7 耐药后细胞免疫表型的改变及临床意义。方法 将人乳腺癌细胞株分为三组：MCF-7（野生组） 、MCF-7/ADM（阿霉素诱导的耐药组） 、MCF-7/撤药 60 天（撤药 60 天组） ，S-P 免疫组化法检测细胞表型变化。结果 MCF-7/ADM 的耐药相关标志蛋白 P-gp、LRP、GST- 及 HER-2 表达较 MCF-7 明显增加，而雌激素受体（ER） 、TOPO-转为阴性表达，孕激素受体（PR）随撤药时间的延长表达逐步减低。结论 耐药细胞的遗传和免疫表型发生了变化，药物作用
2、的靶酶表达或靶功能发生了改变，部分撤药后不能逆转。 【关键词】 多药耐药相关蛋白；人类表皮生长因子受体；雌激素受体；孕激素受体；免疫组化染色 Abstract Objective To investigate immunophenotype change of drug-resistant human breast carcinoma cell line MCF-7 induced by adriamycin.Methods Immunophenotype alteration of MCF-7（wild group） ，MCF-7/ADM（MCF-7 exposed to ADM） and
3、MCF-7/60day（withdrawal 2group，60 days after exposure） was detected by using SP immunohistochmistry method respectively.Results The expression of drug resistance associated marker of MCF-7/ADM cells such as P-gp，LRP，GST- ，HER-2 was higher than MCF-7，ER and TOPO- turned to express negatively.Expressio
4、n of PR decreased gradually after withdrawal.Conclusion MCF-7 cells exposed to ADM got characterization of drug resistant and their immunophenotype alteration could not be reversed after withdrawal. Key words multidrugresistance；human epidermal growth factor receptor-2；estrogen receptor；progesterone
5、 receptor；immunohistochemistry乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，复发率和转移率高，全世界每年约有 120 万妇女发病，有 50 万妇女死于乳腺癌。化学药物疗法是治疗乳腺癌的主要手段之一，但肿瘤细胞产生的多药耐药常使化疗难以奏效并最终导致化疗失败。肿瘤耐药异常复杂，是多基因、多步骤综合作用的结果，我们从多药耐药后乳腺癌细胞免疫表型的改变，对乳腺癌细胞多药耐药的机制进行了研究。31 材料与方法1.1 材料 细胞株：MCF-7 培养于含 10%热灭活小牛血清的RPMI1640 培养液中，细胞传代时用含 0.25%胰蛋白酶进行消化，采用低浓度加量诱导法1-2诱导亲本 M
6、CF-7 细胞，阿霉素（ADM）对亲本 MCF-7 IC50 的 1/10 为起始浓度，逐步提高细胞培养液中的 ADM 浓度，待每个 ADM 浓度细胞稳定生长后再逐步提高药物浓度，同时监测 ADM 对细胞的 IC50。MCF-7 人乳腺癌细胞购于 ATCC 公司， RPMI1640 为 Gibco 公司产品，胰蛋白酶、小牛血清为华美生物工程公司产品，胰岛素注射液为上海生物化学制药厂生产，人 P-gp、LRP、GST-、TOPO-、ER 、PR 免疫组化试剂为福州迈新生物技术公司产品。1.2 方法 把细胞株分成三组：MCF-7、MCF-7/ADM 、MCF-7/撤药 60 天，涂片后进行免疫组织
7、化学染色。把细胞均匀涂在经多基赖氨酸处理的载玻片上，采用 S-P 法，所用一抗为 P-gp、LRP、 GST-、TOPO-、ER、PR 。阳性定位：P-gp 、LRP核膜/胞浆、GST- 胞浆， TOPO- 、ER、PR 胞核，HER-2 胞膜；判断标准：P-gp、LRP、GST- 阳性（+）以上为耐药，TOPO-（-）/（ +）为耐药，ER、PR 阳性细胞数10% 为阳性表达。42 结果免疫组织化学结果，见表 1。MCF-7 多药耐药相关蛋白 P-gp、LRP、 GST- 及 HER-2 阴性表达，TOPO-阳性表达，ER 、PR 阳性表达；MCF-7/ADM P-gp、LRP、 GST-、
8、HER-2 转阳性表达， MCF-7 细胞的标志性受体 ER 转为阴性表达；MCF-7/ 撤药 60 天 P-gp、LRP 表达减弱，GST-、HER-2 表达仍然较强，受体 PR 随撤药时间的延长表达逐步下降（图 1） 。表 1 免疫组织化学结果3 讨论乳腺癌是我国大城市中女性主要癌症之一，传统的治疗手段包括手术、内分泌治疗、化疗和放疗，其中化学药物疗法是治疗乳腺癌的主要手段之一。对化疗药物的耐受，是化疗失败的主要原因。人类在肿瘤的临床化疗中，肿瘤细胞对 1 种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其他多种结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药性，这就是所谓的多药耐药。这是因为药物耐受细胞的遗
9、传和生化特性发生了复杂的变化2 ，使细胞通过许多不同的途径对药物产生耐受，药物作用的靶酶表达改变或靶功能改变。研究多药耐药细胞性质和行为的改变，有助于对多药耐药机制的解析。5耐药的产生往往涉及许多耐药相关标志的表达，许多已被用于化疗过程的监测及疗效判断46 肿瘤耐药机制主要是从多药耐药基因表达的产物入手，主要有 P-gp、LRP、GST-、TOPO-等。P-gp 是一种跨膜糖蛋白，由 MDR1 基因编码所产生，起外流泵作用，能将抗肿瘤药物逆浓度从细胞内泵出到细胞外，从而降低细胞内药物浓度导致肿瘤耐药。LPR 并非只存在于肺部肿瘤中，它广泛分布于正常组织，引起多药耐药的机制是以细胞核为效应的药物
10、转运到胞浆中，将进入胞浆的药物运到运输囊泡中，隔绝药物作用，并以胞吐的方式排出体外，从而产生耐药。TOPO-是一种能催化DNA 起螺旋结构局部构型改变的基本核酶，化疗药物通过该酶与DNA 交联形成共价复合物，即可分割复合物，引起 DNA 断裂，导致肿瘤细胞死亡，该酶减少或活性下降，可使肿瘤细胞不因 DNA断裂而死亡，从而产生耐药。GST- 主要生理功能是参与机体解毒，在许多耐细胞系中，与表达 MDR 表型的细胞系相关，导致肿瘤耐药的可能机制为催化谷胱甘肽与各种亲电子分子和疏水性分子结合，使其更有极性而加强外排，通过非酶结合方式将细胞内的毒性化学药物排除。对乳腺癌患者的调查显示：ER 、PR 阳
11、性者约占乳腺癌的75%，ER 、 PR 阳性乳腺癌虽然也存在肿瘤的异质性，但几乎都具有雌激素诱导的增殖效应，属于内分泌治疗的敏感肿瘤7 。乳腺肿瘤组织不表达 ER、PR，表明该肿瘤细胞已不受内分泌调节，采6取内分泌治疗效果不好，两种受体对于指导治疗、疗效预测及预后评价有很大价值。ER、PR 阳性患者的预后相对较好。HER-2 是一种原癌基因，参与调控细胞的生长、增殖及分化，是公认的重要的肿瘤分子标志物之一8 。其过度表达是多种恶性肿瘤的表型，现也被广泛用于乳腺癌的预后评价及指导治疗9 。HER-2 异常导致乳腺癌危险增加的因素包括：HER-2 基因突变；HER-2 磷酸化状态；其他信号因子及传
12、导通路的异常10 。因此，HER-2 阳性乳腺癌患者较 HER-2 阴性的无瘤生存率和总生存率显著降低。本实验表明：MCF-7/ADM 细胞模型的耐药相关蛋白 P-gp、LRP、 GST- 的表达水平都较 MCF-7 细胞有显著增加，而 MCF-7 细胞的标志性受体 ER 转为阴性表达，受体 PR 随撤药时间的延长表达逐步下降，提示 MCF-7 经 ADM 诱导后细胞产生了多药耐药性，ER、PR、HER-2 等免疫表型也同时发生了改变，且撤药后大多数指标不能逆转。多药耐药机制目前尚未完全了解，其产生是乳腺癌化疗失败的主要原因。从本实验结果可以分析，导致乳腺癌耐药后治疗失败的原因，主要有三个途径
13、：（1）MCF-7/ADM 细胞在获得耐药性的同时，细胞行为发生了变化，耐药细胞具有去分化的能力，且具有生7长优势，对化疗药物有很强的耐受性；（2）ER 表达缺失，失去对雌激素的依赖性，内分泌治疗效果差；（3）HER-2 表达增高。许多研究曾设想用阻断多药耐药的方式达到满意的药效和安全的要求，因而从采用 MDR 逆转剂的研究来解决 MDR 问题，均没有达到预期的效果。笔者从研究中发现 ADM 诱导 MCF-7 细胞耐药后的细胞行为发生了明显变化，为通过研究和完善 MDA 机制及肿瘤细胞 MDR 后的改变、解决 ADM 诱导 MCF-7 细胞耐药后去分化趋势的发展结局，解析其原因并开展肿瘤细胞
14、MDR 的药物靶点研究提供了一定依据。【参考文献】1 Uchiyama-kokubu N，Walanabe T.Establishment and characterization of adriamycin-resistant human colorectal adenocarcinoma HCT-15 cell lines with multidrug resistance.Anticancer Drugs，2001，12（9）：769-779.2 Hosking LK，Whelan RD，Shellard SA，et al.Multiple mechanisms of resistanc
15、e in a series of human testicular teratoma cell lines selected for increasing resistance to etoposide.Int J Cancer，1994 ，57（2 ）：259-267.83 Cowan KH，Batist G，Tulpule A，et al.Imilar biochemical changes associated with multidrug resistance in human breast cancer cells and carcinogeninduced resistance t
16、o xenobiotics in rats.Proc Natl Acad Sci USA，1986，83 ：9328-9332.4 Nakahima-Iiihima S，Hamada H，Reddy P，et al.Molecular structure of the human cytoplasmic beta-actin gene；interspecies homology of sequences in the introns.Proc Natl Acad Sci USA，1985，18 ：6133-6135.5 Izquierdo MA，vsn Der zee AG，Vermorken JB，et al.Drug resistance-associated marker Lrp for prediction of response to chemotherapy and prognoses in advan
