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1、1909年，丹麦生物学家，创造了基因(gene)一词1944年，美国著名微生物学家 O.T. Avery 证明了基因的物质基础是 DNA 1953年，J. Watson 和 F. Crick 的 DNA 双螺旋结构模型, 揭示了 DNA 的分子结构. 特别是 DNA 半保留复制规律。DNA的半保留复制复制子：由复制起点开始合成的一段 DNA 序列。复制起点：在大肠杆菌中其复制起点由 245 个碱基对组成，由两段保守的重复序列组成。1958年，F. Crick 提出了描述 DNA、RNA 和蛋白质三者关系的所谓中心法则(central dogma) 5.基因的表达与调控（操纵子学说）基因依其功能
2、差别可以分成调节基因、操纵基因和结构基因三大类。一、基因工程的概念是指按照人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA 片段），在体外切割、拼接形成重组 DNA，然后将重组 DNA 与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该 DNA 的受体细胞，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出新性状，并能稳定地遗传给下一代。供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。技术上的三大发明：DNA 分子的体外切割与连接技术、基因工程载体的使用、DNA 分子的核苷酸序列分析技术、琼脂糖凝胶电泳和 Southern 转移杂交等技术基因工程的主要研究内容或步骤分、从复杂
3、的生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的 DNA 片段。切、在体外，用限制性内切核酸酶切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体接、在体外，将带有目的基因的外源 DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组 DNA 分子。 转、将重组 DNA 分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞），并与之一起增殖筛、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA 分子的受体细胞克隆表。外源基因的高效表达的措施：1、提高外源基因的剂量2、筛选、修饰充足基因表达的转录调控元件：启动子，增强子，上游调控序列，操作子，终止子3、修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元：选择、修饰和重组
4、核糖体结合位点及密码子等 mRNA 的翻译调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。这些涉及到基因表达调控的分子生物学原理。4、工程菌的稳定生产与增殖：合理控制微型生物反应器的增值速度和最终数量。第二章 基因操作基本技术第一节 凝胶电泳技术电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。一、电泳的基本原理 在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响：颗粒的性质，如：实际电荷，大小及形状，解离强
5、度的难易等。所处的环境，如：电解质或缓冲液的浓度，离子强度，pH，粘度，温度等。应用电场的性质，如：电场强度不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒电场强度下泳动的速度。三、电泳的分类按有无固体支持物区分又可以分为: 自由电泳和支持物电泳两大类四、凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由 D半乳糖和 3、6脱水L半乳糖结合的链状多糖 。 琼脂糖凝胶电泳的原理概述在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作
6、用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。2、DNA 分子的迁移速率由下列多种因素决定:1） DNA 的分子大小: 线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA 分子量成反比。 分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中泳动，因而迁移得越慢。分子越小，所受阻力越小，迁移得越快。2）凝胶浓度凝胶浓度直接影响凝胶的孔径。浓度越高，孔
7、径越小，其分辨力越强。DNA 分子电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。3） DNA 分子的构型 相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的, 共价闭合环环状 DNA（cccDNA ）直线 DNA（ L DNA ）开环的双链环状 DNA(ocDNA)。4） 电源电压 一般电压不得超过 5v/cm。 5） 离子强度影响 在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶 ),电导率最小 ,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加 10电泳缓冲液 ),则电导很高并明显产热 ,严重时会引起凝胶熔化或DNA 变性。 2）缓冲液系统 常用的电泳缓冲液有 EDTA（pH8.0
8、）和 Tris-乙酸（TAE） ，Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE ）等，浓度约为 50mmol/L(pH7.57.8)。3）凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。4）样品配制与加样 DNA 样品用适量 Tris-EDTA 缓冲液溶解，缓冲液内含有 0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有 10%-15%蔗糖或 5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中5）电泳 为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率，电场强度不宜高于 5V/cm。6）染色和拍照 常用荧光染料溴乙锭（EB ）染色，在紫外光下观察 DN
9、A 条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。EB：即 3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐, (Ethidium Bromide)。它能够插入 DNA 分子中的碱基对之间而与 DNA 结合。由于 EB 分子的插入，在波长为 300nm 的紫外光的照射下，凝胶电泳中的 DNA 条带呈现出荧光，易于检测。可以检测 10ng 的 DNA。（四）脉冲电场凝胶电泳一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于 20kb 的 DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA 分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使 DNA 变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大
10、。如此时改变电场方向，则 DNA 分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与 DNA 分子大小关系极为密切。（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶浓度及其分离范围分离 DNA 大小的范围为 1-1000bp蛋白质电泳中 SDS 凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法银染的机制:来源于摄影银染技术 ,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高 50-100 倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需 0.1) 。缺点:可重复性差耗费人力质谱测定有一定的干扰聚丙烯酰胺凝胶的主要优点：分辨率高。具有三种效应
11、：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应；长度仅仅相差0.2(即 500bp 中的 1bp)的 DNA 分子即可分开；（例）所能装载的 DNA 量远远大于琼脂糖凝胶；从聚丙烯酰胺凝胶中回收的 DNA 纯度很高。可根据被分离物质的分子大小控制凝胶浓度制成不同孔径的凝胶。丙烯酰胺较稳定，无色透明，机械强度好，易观察，可用检测仪直接测定。 5、等电聚焦： 在某一 PH 下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此 PH 值即为该蛋白质的等电点。优点：分辨率很高；样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。电泳结束后，可直接测定蛋白质 pI。分离速度快，蛋
12、白质可保持原有生物活性。缺点：电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，可在样品中多加些两性电解质。许多蛋白质在 pI 附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。蛋白质双向电泳中 SDS 凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法、免疫染色法以及蛋白质印迹法。8、蛋白质印迹蛋白质印迹方法将高分辨率的电泳技术与灵敏的、专一的免疫探测技术结合起来,用针对蛋白特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针进行检测.对于蛋白质,通常使用的探针是抗体,它与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应.9、免疫电泳1、抗原抗体特异性反应。2、抗
13、原在 PH8.6 时通常带强负电，而抗体不带电。3、抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应，抗原过量，仅产生可溶性的免疫复合物与抗原一起向阳极移动。4、抗原与抗体浓度达到当量点时，形成免疫沉淀带。免疫电泳：是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。先将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异而彼此分离。然后在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准(或正常) 抗原抗体形成的沉淀
14、线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。对流免疫电泳：双向免疫扩散与电泳相结合的技术。在 pH8.6 的缓冲液中，抗原向正极泳动；而抗体大部分属于 Ig，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 (电渗使液体向负极泳动) 在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向泳动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短反应时间。此法操作简便，仅需 3060 分钟，灵敏度比双向扩散高 1015 倍；但缺点是特异性不如双向琼脂扩散高。火箭免疫电泳：是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时，含
15、于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此，当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)。 DNA 序列分析法:双脱氧末端终止测序法十二烷基磺酸钠 SDS：是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子
16、之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与 SDS 充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。第四章 基因工程载体载体：是一类可供外源 DNA 插入并携带重组 DNA 分子进入适当宿主细胞的 DNA 分子。绝大多数分子克隆实验所使用的载体是 DNA 双链分子。它的本质是 DNA 复制子。复制子(Replicon) ：DNA 中发生复制的独立单位称载体的功能：1. 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2. 为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。3. 为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。一个理想的载体至少应具备以下几个条件：（1）能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制。（2）具有合适的限制性内切酶位点。（3）具有合适的筛选标记，如抗药性基因等。（4）在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增。（5）载体的相对分子质量要小，这样可以容纳较大的外源 DNA 插入片段。（6）在细胞内稳
