《GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA在不同年龄大鼠SVZ和海马表达的变化及其意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA在不同年龄大鼠SVZ和海马表达的变化及其意义（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1GDNFmRNA、GFR. 1 mRNA 在不同年龄大鼠SVZ 和海马表达的变化及其意义作者：刘方舟，杨宁，朱岩，曾水林，潘秋辉，刘云龙 摘要目的: 观察不同年龄 SD 大鼠脑室管膜下区（ SVZ）和海马 GDNFmRNA 及其受体 GFR. 1 mRNA 表达水平的变化，探讨其在神经发生及脑老化中的作用。 方法: 用 RT.PCR 方法检测胚胎 18d、新生以及 1、 3、8、12 月龄 SD 大鼠 SVZ 和海马GDNFmRNA 及其受体 GFR. 1 mRNA 的变化。 结果: 随着年龄增长，SD 大鼠 SVZ 和海马 GDNFmRNA 及其受体 GFR. 1 mRNA 表达水平逐渐降
2、低。且各年龄组海马表达参数的幅度小于SVZ。 结论 : GDNF 及其受体 GFR. 1 在神经发育及脑老化进程中起到一定的作用。关键词 脑室管膜下区;海马;胶质细胞源性神经营养因子;胶质细胞源性神经营养因子受体. 1 ;大鼠 近年来神经科学研究的一项重要进展是，发现成年哺乳动物脑内某些特定区域在正常状态下存在神经发生现象。其中脑室管膜下区（subventricular zone，SVZ ）和海马颗粒下层（subgranular layer zone，SGZ ）已被证实是神经前体细胞产生最为活跃的区域1， 2 。成年脑的神经发生现象局限于特定的2脑区，提示相关生发脑区的微环境可能对神经发生起着
3、重要作用。也有的研究证明微环境的变化与脑老化的过程相关。脑的神经发生与脑老化有可能就是微环境变化影响神经前体细胞的结果。神经生长因子是目前研究最多的调节因子，在体内外，EGF、FGF、IGF.1等均可刺激 SVZ 细胞增殖，甚至可以调节神经前体细胞的定向分化3，4 。转化生长因子.（transforming growth factor.，TGF. ）超家族成员的胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-de-rived neurotrophic factor，GDNF）是现有神经营养因子作用最强的一种5 ，因其广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用而成为近年来的研究热
4、点。GDNF 的受体由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇（GPI） ，称为 GDNF 家族受体 1-4 （GDNF family recep-tor 1-4 ，GFR. 1-4 ）和 GDNF 功能性受体孤儿酪氨酸 RET 蛋白（由原癌基因 C.RET 编码）所组成。当 GDNF 结合于 GFR.（主要高亲和性地结合于 GFR.1 ）时，通过招募 RET 蛋白形成受体复合物激活下游信号转导途径，从而产生生物学效应6 。另外研究发现，缺乏 RET 时，GDNF 通过激活 GFR. 1 相关 Src 蛋白样激酶途径进行信号转导7 ，故 GDNF 信号转导途径具有依赖和不依赖RET 蛋白两种方式，而 G
5、FR. 1 是两者的关键信号转导分子。现在已知中枢神经系统的可塑性和修复能力随年龄的增加而3下降，神经发生现象也随年龄增加而降低，但作为具有广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用的 GDNF 及其受体GFR. 1 ，在不同年龄大鼠的表达水平是否与神经发生有关? 其增龄变化目前还不是很清楚，尤其从分子水平研究 GDNF 及其受体的增龄性变化尚未见报道。本研究采用 RT.PCR 方法观察了不同年龄大鼠 GDNF 及其受体 GFR. 1 在 SVZ、海马的表达变化，探讨其在神经发生及脑老化进程中的生物学意义。 1 材料与方法1.1 材料RNA 抽提试剂盒 TrizolReagent（Gib
6、co ） ，RT.PCR 试剂盒（TaKaRa） ，Tris 碱、溴酚蓝、EB、EDTA、琼脂糖，SDS （上海生工生物工程公司） ，DEPC （Fluka 公司） ， DNA 分子质量标准 DNA Marker DL2000（TaKaRa） 。GDNF 分子引物序列:上游引物5.GACTCCAATGTGCCCGAAGA.3，下游引物5.CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC.3，该引物产生 394bp 的cDNA 片段;GFR. 1 分子引物序列: 上游引物5.CTGGAAAGATGAACCGATTG.3，下游引物5.CTCTGTGAGAGGGTGAGAAG.3，该引物产生 290bp
7、 的 cDNA片段。上述引物由作者潘秋辉设计。.actin 分子引物序列:上游引物45.ATGCCATCCTGCGTCTGGA CCTGGC.3，下游引物5.AGCATTTGCGGTGCACGATGG AGGG.3，该引物产生 603bp的 cDNA 片段，上述引物序列由上海生工生物工程公司合成。1.2 动物分组与取材SD 大鼠每组 4 只，分为孕 18d（取胚胎） 、新生以及1、3 、8 、 12 月龄 6 组（由中山大学第二附属医院实验动物中心提供） 。孕 18d 组大鼠以 0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在体视显微镜下取出胚胎，快速分离胚胎大脑组织，显微镜下分离侧脑室周围区域与海马，用
8、0.01molL -1 PBS 液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。其余 5 组大鼠以 0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，按 Swanson 大鼠脑图谱8 ，于坐标bregma+1.45、bregma+0.45 处进行定位，快速断头、剥离侧脑室周围区域（切取双侧侧脑室外侧壁自室腔面向外侧，其厚度约为1.0mm） 9 与海马组织，用 0.01molL 1 PBS 液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。 1.3 RNA 抽提、RT 反应及 PCR 扩增过程1.3.1 大鼠 SVZ、海马组织 RNA 的抽提 分别取50100mg 脑室管膜下区和海马冻存脑组织，采用 Trizol 一步法5获得
9、 RNA，RT 和 PCR 反应过程前取少量作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析。1.3.2 RT 反应 在无 Rnasin 的离心管中依次加入总 RNA2l和 DEPC 处理水 7.5l，99变性 5min，冰浴 5min，然后加入终浓度为 5mmolL -1 的 MgCl 2 4l、 1RTbuffer2l、1mmolL -1 的 dNTP2l、20U的 rnasin0.5l、15U 的 RT1l、Oligo （dT15）1l ，42 水浴45min，99水浴 5min，然后冰浴 5min，产物置于-20保存备用。1.3.3 PCR 扩增 在 0.5ml 的薄壁离心管中依次加入 RT 产物2l、
10、 25mmolL -1 的 MgCl 2 2l、10buffer4l、终浓度为 0.2mmolL -1 的 dNTP、30molL -1 的 Primer（GDNF 、GFR. 1 ）1.2l 、1Ul -1 的 Taq酶 1.5l、DEPC 处理水 31.3l、石蜡油 50l，瞬时离心后于 94 反应 7min，然后在 941min、541min、721min 下反应 35个循环，最后在 72下反应 10min。产物于 4下保存备用。.actin 扩增反应同上述步骤，用作 RT.PCR 检测基因表达时的阳性对照。 1.4 PCR 产物检测与数据处理6PCR 产物 10l 上样于含溴化乙锭的
11、2%琼脂糖凝胶，电压降为 5Vcm -1 ，凝胶扫描系统进行密度扫描后，以对应组.actin 密度为 100%对照校正，用凝胶图像分析系统（ leica）进行扩增产物半定量分析，得到 GDNFmRNA、GFR. 1 mRNA 的光密度值，结果以xs 表示，用 t 检验比较各组标本差异的显著性。 2 结果2.1 不同年龄大鼠 SVZ、海马总 mRNA 分析在 1%琼脂糖凝胶电泳上可见 28s 和 18s 两个清晰条带，28s 与 18s 比值约为 21，未见明显降解。用紫外分光光度计测抽提的总 RNA 的 OD 260nm 、OD 280nm 。结果显示，OD 260nm .OD 280nm 1
12、.8。表明抽提的总 RNA 没有蛋白质和其他杂质的污染，纯度较高，可以用作 RT 的模板。总 RNA 得率 SVZ多于海马组织。2.2 大鼠 SVZ、海马 .actin mRNA 的表达在 SD 大鼠 SVZ、海马组织总 RNA 扩增出 603bp DNA 片段，与预计结果吻合。灰度扫描时定为 100%标准。72.3 不同年龄大鼠 SVZ、海马 GDNF mRNA、GFR. 1 mRNA 的表达GDNFmRNART 产物经 PCR 扩增得到约 394bp 的 cDNA片段，GFR. 1 mRNA RT 产物经 PCR 扩增得到约 290bp 的cDNA 片段，与设计结果相同。结果显示 SVZ
13、GDNFmRNA 在胚胎及新生大鼠表达水平较高;出生后至成年期（18 月龄）呈缓慢下降的趋势，各组间差异不明显，但显著低于胚胎及新生大鼠。老年期（12 月龄）大鼠的 GDNFmRNA 表达水平则明显降低（见表 1、图 1） 。不同年龄组 SVZ GFR. 1 mRNA 表达的变化与GDNFmRNA 表达的变化趋势相似。海马区 GDNF mR-NA 在胚胎期表达水平相对较低，新生大鼠表达水平相对胚胎期有明显上调，后随年龄的增大逐渐下降。而海马区 GFR. 1 mRNA 在胚胎期表达相对较多，新生大鼠表达相对胚胎期无明显变化，后在各年龄组呈低表达，在老年大鼠未见表达或见很少量的表达（表 2、图 2
14、） 。 表 1 不同年龄大鼠 SVZ、海马 GDNFmRNA 表达情况（略）Tab1 GDNFmRNA gene expression in subventricular zone and hippocampus，using semi-quantitative RT.PCR method with.actin as a inner consult8与孕 18d 鼠比较，1 ）P0.05 ，2）P0.0116.依次代表孕 18d、新生以及 1、3、8、12 月龄大鼠;M.Marker图 1 不同年龄大鼠海马 GDNFmRNA、GFR. 1 mRNA 表达变化电泳图（略）Fig1 RT.PCR a
15、nalysis of GDNF mRNA、GFR. 1 mRNA expression in hippocampus16.依次代表孕 18d、新生以及 1、3、8、12 月龄大鼠;M.Marker图 2 不同年龄大鼠 SVZ GDNFmRNA、GFR. 1 mRNA 表达变化电泳图（略）Fig2 RT.PCR analysis of GDNF mRNA、GFR. 1 mRNA expression in subventricular zone 表 2 不同年龄大鼠 SVZ、海马 GFR. 1 mRNA 表达情况9（略）Tab2 GFR. 1 mRNA gene expression in su
16、bventricular zone and hippocampus，using semi-quantitative RT.PCR method with.actin as a inner consult与新生鼠比较，1 ）P0.05 ，2）P0.013 讨论GDNF 是 1993 年由小鼠胶质细胞系 B 49 中分离出的糖基化的二硫键结合的同源二聚体蛋白质，属于 TGF. 超家族成员。最初的研究发现，GDNF 具有促进大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元存活、形态分化和增强其摄取多巴胺的能力。近年来的实验证实，GDNF是一种多效能神经营养因子，对中枢及周围神经系统不同种类神经元的发育、存活及再生有一定的支持作用。Jing 等采用“表达克隆法（expression cloning
