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1、年生物化学实验 B实验报告姓 名： 学 号： 实验时间： 实验分组： 组内成员： 任课教师： 小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量摘要 本实验从新鲜且冷冻保存的小牛肠出发,通过刮取、离心分离、析出、提纯等方式提取小牛肠中碱性磷酸酶，利用紫外分光光度法测定该酶的活性，并利用考马斯亮蓝法测定所提取的蛋白质含量，最后通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对比 marker 谱带近似得出蛋白样品中蛋白质的相对分子量。关键词 碱性磷酸酶；分离纯化；酶活；紫外分光光度法；考马斯亮蓝；蛋白质；聚丙烯酰胺凝胶；蛋白质分子量。前言 碱性磷酸酶能
2、催化核酸分子脱掉 5-磷酸基团，从而使 DNA 或 RNA 片段的 5-P 末端转换成 5-OH 末端。主要应用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。本实验以小牛肠为原料，分离纯化小牛肠碱性磷酸酶并研究酶活。小牛肠碱性磷酸酶的分子量为 145000，等电点为 5.7.碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠，使之水解释放出对硝基苯酚，后者在 405nm 光波长下有最大吸收。通过测定吸光值的变化率，可测定酚的生成量，从而计算出酶的活性单位。应用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，是一种常用的蛋白质快速微量测定法。考马斯亮蓝 G-250 在
3、酸性溶液中的游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为 465nm，后者为 595nm。在一定蛋白浓度范围内（0.011.0mg/ml ）,蛋白质-色素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白酶分子质量，根据标准样品在电泳中所做出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。 1 实验部分1.1 试剂与仪器1.1.1 试剂（1）正丁醇、丙酮（置-20冰箱保存） ；（2）1 mol/L 醋酸（HAc） ，1 mol/L NaOH，硫酸铵；（3）平衡缓冲液：0.01 mol/L Tris-HC
4、l，pH=8.0；（4）底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液,pH=9.8；（5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制 1510-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液（已加入到底物缓冲液中） ；（6）30% 丙烯酰胺（acrylamide，Acr）置棕色瓶；（7）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH=8.8，已加入 10% SDS；（8）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH=6.8，已加入 10% SDS；（9）10% 过硫酸铵（AP）（小离心管装，提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必需的自由基，需新鲜配制） ；（10）TEMED
5、（四甲基乙二胺）（小离心管装 T，通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合）；（11）上样缓冲液（小离心管装 S）：称 100 mg SDS、2 mg 溴酚蓝、2 g 甘油，加 0.1 mL 巯基乙醇、2 mL 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl，加超纯水定容至 10 mL；（12）染色液：配置含 0.1% 考马斯亮蓝 R250，40%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的染色液 500 mL，过滤后备用；（13）脱色液：500 mL 10%（体积分数）甲醇和 10%（体积分数）冰醋酸的脱色液 1000 mL；（14）电泳缓冲液（含 0.1%SDS，0.
6、05mol/L Tris,0.384mol/L 甘氨酸 pH=8.3） 。1.1.2 仪器匀浆机、冷冻离心机、恒温水浴、紫外可见分光光度计、离心管、剪刀、载玻片、不锈钢盘、搪瓷盘、滤布、漏斗、分液漏斗、量筒、烧杯、移液枪、比色皿（光程 0.5cm 和 1.0cm 各两个） 、电泳仪、电泳槽、制胶板、揺床。1.2 实验过程1.2.1 小牛肠碱性磷酸酶的提取1）取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮取小肠内粘膜，放到盘子一角。2）将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中，加 1.5 倍体积冰冷蒸馏水，高速匀浆，重复 20 次。3）缓慢加入（总体积）一倍体积冰冷正丁醇高速匀浆 15s，重复 20 次。取 60
7、mL匀浆液放入离心管中，另一离心管用水配平，在 4、10000 rpm 条件下离心15min。4）用滤布过滤去除杂质（滤饼） ，倒入分液漏斗中，静止分层，取下层水相，用1mol/L HAc 溶液调 pH 到 4.9。4、10000 rpm 条件下，离心 10min。5）得到上清液 29.5ml 放入离心管中，用 NaOH 溶液调 pH 至 6.5，称取 1.475g 硫酸铵加到离心管中溶解；再加 13.87ml 冰冷丙酮，混匀，4静置 30 min以上。4，10000 rpm，离心 10min。6）上清液中 42.0ml ，加入 45.0ml 冰冷丙酮，4放置 30 min 以上。4，1000
8、0 rpm，离心 10min。7）取沉淀溶于 1.5ml 平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。8）底物处理：底物 37水浴 5 min。1.2.2 小牛肠碱性磷酸活的检测1）将酶稀释 10 倍。2）紫外分光光度计检测条件为 405 nm 波长，测定时间 60 s，取值 2 s，记录范围 0.0-1.5。3）取 2 个 2 mL 比色皿（光程 0.5cm） ，加入上述（2）加热的底物缓冲液，校对归零。4）将稀释 10 倍的酶液 20L 加到其中 1 个比色皿中（仪器外侧） ，用手堵住皿口。快速上下倒 2 次，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线1.2.3 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1）玻璃试管中加
9、入 5ml 考马斯亮蓝。2）在 1.5 mL 离心管中，取酶液稀释 10 倍。 3）取 100L 加入到 5 mL 考马斯亮蓝试管中，混匀，反应 5 min 以上（液体呈浅蓝色） 。4）紫外分光光度计检测条件：595 nm 波长。5）取 2 个比色皿（1.0cm 光程） ，加入考马斯亮蓝（比色皿三分之二） ，分光光度计中校对归零。 6）将样品放入外侧比色皿中，读吸光值。7）根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度。1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶制备1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度
10、的分离胶。分离胶制备（浓度 10%，制备量 10 mL）试剂 用量H2O 4.1 mL30% 丙烯酰胺 3.4 mL1.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液 pH 8.8 2.4 mL10% 过硫酸铵 100 LTEMED 10 L注意：最后加入 TEMED，应快速摇匀分离胶，向玻璃板间隙，沿着长玻璃板的内侧缓缓注胶，然后再用移液枪贴壁慢慢移动注入乙醇 200L，以防止氧气进入胶内。10-15min 后，分离胶和乙醇之间出现分界线，表明分离胶凝固，倒出乙醇。3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。注意：一旦加入 TEMED，应快速摇匀浓缩胶，在已凝固的分离胶层上加浓缩胶，立即
11、将梳子插入胶液顶部，避免进入气泡，放置约 20min,待浓缩胶凝固。 4）蛋白样品处理：在 1.5 mL 离心管中按 1：1 体积比例，加样品（0.3mL）和上样缓冲液（0.3mL） ，100C 加热 3min 使蛋白变性。5）浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子，将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液，缓冲液高过玻璃板凹面。1.2.5 SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量1）用移液枪依次在泳道各加样 20 微升，并在中间泳道加 marker 溶液。2）电泳：连接正、负极，打开电源。开始时电流控制在 40mA，样品进入分离胶后缓慢升高电压至 140V，或电流 5060mA
12、 保持电压电流不变，待溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳（约 1.5 小时） 。3）剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，用金属片从玻璃板两侧轻撬，使空气进入，同时用水冲洗，取出凝胶板，将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色 10min。4）脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，30min换一次脱色液，脱色至背景清晰。5）观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。6）拍照电泳结果，用于完成实验报告。浓缩胶制备（浓度 5%，制备量 6 mL）试剂 用量H2O 3.4 mL30% 丙烯酰胺 1.0 mL0.5 mo
13、l/L Tris-HCl 缓冲液 pH 6.8 1.5 mL10% 过硫酸铵 60 LTEMED 8 L2 结果与讨论2.1 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量根据考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线，其方程为：y=0.697x-0.007(相关度R2=0.9989)；蛋白质稀释 10 倍的情况下测得吸光值为 0.2283 A。根据方程计算，稀释 10 倍时蛋白质浓度 C1=0.3375mg/ml 则原蛋白质浓度 C=3.376mg/ml2.2 小牛肠碱性磷酸活性的检测用分光光度计测定酶动力曲线。405nm 波长下的吸光值的变化率根据酶动力计算公式：比活力（U/mg）A/min VR DE405 VE C
14、 L由图可知:A/min= （0.2600-0.0300 ）/min=0.2300/min,405nm 波长下的吸光值的变化率；VR=1.52ml，反应液的体积，ml；D=10，稀释倍数；E405=18.3L/(molcm)，405nm 波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数；VE=0.02ml，所加酶液体积，ml；C=3.376mg/ml， 蛋白的原始浓度，mg/ml；L=0.5cm，比色皿光程；所以比活力（U/mg）=5659U/mg（说明酶的活性还是很高的） 。2.3 SDS-聚丙烯凝胶电泳根据电泳图可知，mark 中出现了 4 条明显的蛋白质标记线，根据其间距（即相对分子量的差距）及参考文献中
15、给出的 mark 泳道（左数第六条）各条蛋白质标记线间距，可判定由上到下 mark 泳道中的 4 条蛋白质标记线分别是兔磷酸化酶B（97400），牛血清白蛋白（66200），兔肌动蛋白(43000),牛碳酸酐酶（31000）。样品蛋白质标记线与牛血清白蛋白（66200）迁移率相近，所以样品的分子量与牛血清白蛋白分子量相近，所以样品的分子量大致为 66200g/mol。发现样品中存在一些较浅的的标记线，原因可能是存在一些杂质蛋白，造成样品不纯，今后的实验中应注意分离提纯的操作。2.4 思考与讨论在测定底物浓度对酶反应速度的影响时，要对反应温度、酶浓度进行控制，本实验将反应底物恒温 37水浴 5
16、分钟，保证了反应温度统一（加入酶液产生的温度变化可忽略不计），酶浓度为在原来酶浓度的基础上稀释 10 倍，这样酶的浓度比较适宜，便于测量。小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定实验中，最关键的地方在于提取酶的时候要在低温环境下，防止酶失活，所以所用的丙酮等溶剂均是从冰箱中取出。另外，测定酶活力的时候底物预热后要立即进行反应，防止底物提前分解影响实验测定。在电泳实验中，电极缓冲液中加入甘氨酸，其与 Tris 一起组成电极缓冲液中的缓冲对，使得电泳时 pH 变化不大，保证实验的条件不变，消除 pH 对实验的影响。分离胶与浓缩胶中均含有 TEMED 和 AP，TEMED 可以通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合而 AP 提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必需的自由基。在电泳中，加入十
