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1、1骨桥蛋白在乳头状甲状腺癌中的表达及意义作者：孙咏梅刘韶平马喆王正滨吴俐【摘要 】 目的：通过 mRNA 和蛋白质水平检测乳头状甲状腺癌组织中骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达 ,探讨其与甲状腺癌发生、发展的关系。方法：收集 48 例新鲜的乳头状甲状腺癌组织，采用实时荧光定量 PCR 法检测 OPN mRNA 的表达，通过免疫组织化学方法检测组织中 OPN 的表达。30 例甲状腺良性病变及 20 例正常甲状腺组织作为对照。结果：乳头状甲状腺癌组织中 OPN mRNA 的表达水平为 56.8249.16,高于甲状腺良性病变组织（19.7228.56）及正常甲状腺组织（13.7620
2、.65） 。免疫组织化学结果表明,OPN 主要定位于癌细胞的细胞质，OPN 蛋白表达结果与 mRNA 基本一致。 OPN mRNA 的表达与乳头状甲状腺癌的瘤灶数目、瘤体大小、肿瘤淋巴结转移及肿瘤临床分期无明显相关性（P0.05）, 病理发现砂粒体的乳头状甲状腺癌 OPN mRNA 的表达高于未发现砂粒体者（P0.05 ） 。结论： OPN 在乳头状甲状腺癌中的表达高于甲状腺良性病变及正常甲状腺组织。乳头状甲状腺癌 OPN mRNA 的表达量与病理砂粒体的存在相关。OPN 在乳头状甲状腺癌的发生、发展中发挥一定作用。 【关键词】 甲状腺肿瘤骨桥蛋白聚合酶链反应2【ABSTRACT】 Objec
3、tive： To investigate the expressions of osteopontin in human thyroid papillary carcinoma. Methods： Forty-eight fresh samples of thyroid papillary carcinoma were collected. The expressions of OPN mRNA and protein were analyzed by using FQ - PCR and immunohistochemical staining respectively. Thirty sa
4、mples of thyroid benign lesions and 20 samples of normal thyroid tissues were selected as control group. Results： The expression levels of OPN mRNA and protein in thyroid papillary carcinoma were higher than those of control. No significant relevance was found between the expression of OPN and clini
5、cal features（include lesion numbers, tumor size, lymph metastasis and TNM stage）. The expression levels of OPN mRNA were related with psammoma bodies in tumor tissue. Conclusions： The expression levels of OPN in thyroid papillary carcinoma were higher than benign lesions and normal thyroid tissues.
6、The expression levels of OPN mRNA was related with psammoma bodies in tumor tissue. OPN may play a role in the development of thyroid papillary carcinoma.3【KEY WORDS】 Thyroid neoplasmsOsteopontinPolymerase chain reaction甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，主要组织学类型包括乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌,其中乳头状癌占所有甲状腺恶性肿瘤的 75%以上。甲状腺癌发病率呈逐
7、年上升趋势，迄今为止尚无明确的预防措施和控制手段,有关甲状腺癌的发病机制及有效治疗手段仍在不断探索中。骨桥蛋白（osteopontin，OPN ）是一富含精氨酸-甘氨酸- 天冬氨酸（RGD）序列的磷酸化糖蛋白 ,参与细胞信号转导,促进细胞粘附和迁移, 与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移密切相关，近年被认为是一个新的肿瘤标志物2 。本研究分别从mRNA 和蛋白质水平检测乳头状甲状腺癌组织中 OPN 的表达,探讨OPN 与甲状腺癌发生、发展的关系。1资料与方法1.1一般资料选择 2006 年 6 月2008 年 2 月在青岛大学医学院附属医院普外科收治的经病理组织学检查证实为乳头状甲状腺癌的患者 48
8、例，病例资料均完整。其中男 13 例，女 35 例，年龄1968 岁，平均年龄 43.6 岁，中位年龄 41 岁；淋巴结转移 19 例，无淋巴结转移 29 例；临床 TNM 分期（参照 UICC1987 年分期标准）：期 33 例，期 15 例。另选取同院同期甲状腺良4性病变组织标本 30 例，其中男 11 例，女 19 例，年龄 2171 岁，平均年龄 45.2 岁，中位年龄 43 岁，包括结节性甲状腺肿 23 例，甲状腺腺瘤 7 例；正常甲状腺组织 20 例，取自良性病变周围组织。所有患者术前均未接受放、化疗及其他药物治疗。所有标本均在手术切除后半小时内处理完毕，每例标本均分成两份,一份用
9、 4%甲醛固定, 作常规病理及免疫组织化学染色，另一份置于-80液氮罐中。1.2主要试剂PCR 引物及探针：从 PUBMED/Nucleotide GenBank 中查出 OPN 基因全序列，以 GAPDH 基因序列作为内参照，应用 Primer Premier 5.0 软件，设计引物。经预实验后，确定探针序列，由上海生物工程技术服务有限公司合成。OPN 5端引物序列 5-AGGACTCCATTGACTCGAACGA-3, 3端引物序列为 5-CACCTCGGCCATCATATGTGT-3，扩增产物长度为 183 bp。OPN Taqman 探针序列：5-ACGGACCTGCCAGCAACCG
10、AAGTT-3；内参照基因采用葡萄糖磷酸脱氢酶（GAPDH） , 5端引物序列为 5-ACTCTGGCAAAGTGGATGTTGTC-3, 3端引物序列为 5-GCATCACCCCACTTGATGTTG-3，扩增产物长度为 150 bp。GAPDH Taqman 探针序列为 5-ATGATTCCACCCACGGCAAGTTCCA-3。荧光定量 PCR 两步法试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，RNA 提取试剂盒购自上海生5物工程技术服务有限公司，鼠抗人 OPN 单克隆抗体（一抗）及羊抗鼠 IgG（二抗）购自北京中山生物技术公司。1.3检测方法1.3.1实时荧光定量聚合酶链反应测 OPN mRNA
11、 1）RNA的提取及 cDNA 的合成。将冻存的手术标本取出，总 RNA 提取参照 Trizol 试剂盒说明逐步操作。成功提取后，取适量 RNA 进行甲醛变性凝胶电泳，并用紫外分光光度计测定波长 260 nm 和 280 nm 处吸光度值，计算 A260A280 比值（ OD 值） ，确定 RNA 的含量、浓度和纯度。参照实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）试剂盒要求的条件对提取的总 RNA 进行逆转录反应，均采用10 L 反应体系，所得 cDNA 用于 PCR 扩增。 2）PCR 扩增条件及OPN 序列测定。以 GAPDH 为内参照进行 PCR 扩增。条件为 95预变性 1
12、0 s，95变性 5 s，60 延伸 45 s,共 40 循环。取 10 L PCR 扩增产物，采用 2%琼脂糖凝胶电泳,以 DL600 为分子量参照,紫外透射仪下观察拍照。PCR 产物送上海生物工程公司进行纯化,测序鉴定。3）Real-Time PCR。使用 7500 Real-Time PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司） ，按照试剂说明书提供的参考用量及终浓度范围，制备 PCR 反应混合液。用 20 L 反应体系，以最佳PCR 条件扩增 40 个循环。由 PCR 仪采集、分析荧光信号,自动生成荧光强度曲线，计算反应体系中待测样本 GAPDH 及 OPN 基因的6
13、Ct 值。1.3.2免疫组织化学法检测组织中 OPN 蛋白的表达标本石蜡包埋、切片，常规脱蜡至水化,以 3的过氧化氢灭活内源性酶 15 min，微波炉加热 15 min 修复抗原，自然冷却，滴加非免疫性羊血清，以阻断组织中的非特异性结合。依次滴加 OPN 鼠抗人单抗（一抗） 、羊抗鼠 IgG（二抗） 、SP 液、DAB 显色 35 min，苏木精复染、脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察。PBS 液代替一抗作为阴性对照。观察不同甲状腺组织中 OPN 的蛋白表达。1.4结果判定1.4.1Real-Time PCR 定量分析本研究用 Ct 方法进行目的基因的相对定量检测，计算公式为：Ct = C
14、t GI（未知样品）- Ct GAPDH（未知样品）- Ct GI（校正样品）- Ct GAPDH（校正样品），用 2-Ct 表示目的基因 OPN 的相对表达量。2-Ct值越高，表明样本的 OPN mRNA 含量越高。1.4.2免疫组织化学检测每例标本均由两位经验丰富的病理科医师读片,以细胞质棕黄色染色且无非特异性背景染色的细胞为阳性细胞, 选择 5 个高倍视野，按阳性细胞数占同类细胞的百分比，将结果分为：阴性（-） ，50。其中（-）和（+ ）为低表达， （+ ）和（+）为高表达。1.5统计学处理应用 SPSS10.0 软件包进行统计学分析。计量资料以 xs 表示,样本率的比较采用 2 检验
15、和 Fisher 精确概率法,样本均数的比较采用单因素方差分析和 t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1骨桥蛋白 mRNA 在不同甲状腺组织中的表达电泳所得PCR 产物经序列测定证实为目的基因（图 1） 。48 例乳头状甲状腺癌组织中 OPN mRNA 表达的范围为 9.58298.93，均值为56.8249.16。30 例甲状腺良性病变组织中 OPN mRNA 的表达范围为 1.3084.43,均值为 19.7228.56。20 例正常甲状腺组织中OPN mRNA 的表达的范围为 2.5547.83,均值为13.7620.65（图 2） 。经单因素方差分析检验,乳头状甲状腺癌
16、组织中 OPN mRNA 的表达高于甲状腺良性病变（P=0.013）和正常甲状腺组织（P=0.003）, 甲状腺良性病变与正常甲状腺组织表达差异无统计学意义（P=0.779） 。2.2不同甲状腺组织免疫组织化学结果 免疫组织化学结果显示,OPN 的阳性免疫组织化学染色呈棕褐色,主要定位于肿瘤细胞质8（图 3） 。本研究 48 例乳头状甲状腺癌组织，OPN 蛋白阳性表达率为 89.58%（43/48） ，其中高表达率为 70.83%（34/48） ；对照组30 例甲状腺良性病变组织中 OPN 蛋白阳性表达率为53.3%（16/30）,高表达率为 20%（6/30） ；20 例正常甲状腺组织中 OPN 阳性表达率为 45%
