药物筛选新方法_高通量筛选

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1、药 物 筛 选 新 方 法 高 通 量 筛 选徐 志 红 蒋 志 胜 (南 开 大 学 元 素 有 机 化 学 研 究 所 元 素 有 机 化 学 国 家 重 点 实 验 室 天 津 300071)摘 要 介 绍 了 高 通 量 筛 选 的 概 念 、 原 理 及 其 各 个 组 成 部 分 , 着 重 阐 明 了 高 通 量 筛 选 的筛 选 模 式 、 检 测 方 法 和 应 用 实 例 , 并 简 单 介 绍 了 国 内 在 这 方 面 的 研 究 进 展 。关 键 词 高 通 量 筛 选 筛 选 模 式 检 测 方 法在 药 物 研 究 中 , 具 有 生 物 活 性 物 质 的 发

2、现 是 一 个重 要 的 过 程 , 药 物 发 现 有 两 种 方 式 , 即 偶 然 发 现 和 药 物筛 选 , 其 中 偶 然 发 现 并 不 可 靠 , 药 物 筛 选 才 是 药 物 研 究中 极 其 重 要 的 内 容 。药 物 筛 选 , 就 是 对 可 能 作 为 药 用 的 物 质 进 行 初 步药 理 活 性 的 检 测 和 试 验 , 以 求 发 现 其 药 用 价 值 和 临 床用 途 , 为 发 展 新 药 提 供 最 初 始 的 依 据 和 资 料 1 。 根 据 所选 材 料 和 药 物 作 用 对 象 , 药 物 筛 选 大 致 分 为 两 类 : 动 物实

3、验 (包 括 动 物 整 体 筛 选 和 组 织 器 官 筛 选 ) 和 细 胞 分 子水 平 筛 选 , 其 特 点 如 下 表 :2 种 筛 选 方 法 的 特 点 比 较优 点 缺 点 举 例动 物 实 验 反 映 药 物 的 整 体 治 疗 作 用 ,不 良 反 应 和 毒 性 作 用手 工 操 作 ,所 需 时 间 长 ,劳动 强 度 大 ,技 术 要 求 高 ,样品 量 大离 体 血 管试 验细 胞 分 子水 平 筛 选能 直 接 反 映 药 物 作 用 机 理 ,操 作 能 机 械 化 、 微 量 化 、 自 动化 、 低 费 用 、 快 速 化不 能 直 接 反 映 药 物 作

4、 用 高 通 量筛 选近 年 来 , 细 胞 生 物 学 、 分 子 药 理 学 、 生 物 化 学 及 病理 学 等 学 科 的 发 展 , 为 观 察 药 物 作 用 提 供 了 新 的 方 法 ,大 量 分 子 细 胞 水 平 的 药 物 筛 选 模 型 不 断 出 现 , 并 应 用到 药 物 筛 选 和 研 究 中 , 使 细 胞 分 子 水 平 筛 选 方 法 能 真正 实 现 一 物 多 筛 和 多 物 一 筛 , 并 配 合 组 合 化 学 技 术 、 灵敏 的 检 测 技 术 、 微 电 子 技 术 、 自 动 化 技 术 和 计 算 机 技 术而 形 成 高 通 量 筛 选

5、 (h igh th roughput screening, H T S) ,极 大 的 减 少 了 供 试 化 合 物 和 试 剂 的 用 量 (最 低 用 量 为10- 12L ) , 降 低 药 物 筛 选 的 成 本 , 实 现 了 每 日 筛 选 10 万化 合 物 的 目 标 , 成 为 新 药 发 现 的 强 大 武 器 。H T S, 就 是 以 分 子 细 胞 水 平 的 实 验 方 法 为 基 础 , 以微 型 板 为 实 验 工 具 载 体 , 以 自 动 化 操 作 系 统 执 行 实 验过 程 , 以 灵 敏 快 速 的 检 测 仪 器 采 集 实 验 数 据 , 以

6、 计 算 机对 实 验 获 得 的 数 据 进 行 分 析 处 理 , 同 时 对 数 以 万 计 的样 品 进 行 检 测 。 由 此 可 知 , H T S 由 5 部 分 组 成 : 1)供 试的 大 量 样 品 (即 样 品 库 ); 2) 分 子 细 胞 水 平 的 特 异 性 体外 体 内 筛 选 模 型 ; 3) 高 灵 敏 度 检 测 系 统 ; 4) 自 动 化 操 作系 统 ; 5) 数 据 采 集 传 输 处 理 系 统 。 此 外 , 还 有 计 算 机 辅助 设 计 、 组 合 化 学 、 高 效 天 然 化 合 物 提 取 方 法 等 辅 助 系统 。 现 介 绍

7、如 下 :1 供 试 的 大 量 样 品1. 1 已 有 的 化 合 物 库 一 些 大 制 药 公 司 搜 集 大 量 不同 结 构 的 有 机 化 合 物 , 如 Exielixis 公 司 已 建 立 了 一 个超 过 2 000 000 个 化 合 物 的 特 大 型 化 合 物 库 。 这 些 化 合物 绝 大 部 分 是 小 分 子 , 容 易 筛 选 出 具 有 潜 在 类 似 化 合物 的 合 成 和 筛 选 。1. 2 天 然 产 物 长 期 以 来 , 植 物 成 分 是 开 发 新 药 的 最重 要 的 来 源 , 如 吗 啡 、 喹 啉 、 喹 尼 丁 和 阿 托 品

8、等 均 来 自于 植 物 。 微 生 物 代 谢 也 是 新 药 的 一 个 重 要 来 源 , 如 青 霉素 等 。 此 外 , 海 洋 生 物 占 全 球 生 物 多 样 性 的 一 半 , 估 计有 300 万 500 万 , 是 另 一 类 巨 大 的 宝 藏 。1. 3 组 合 肽 库 组 合 肽 库 的 合 成 技 术 主 要 采 用 “ 一 珠一 肽 ” , 生 物 学 法 和 同 步 合 成 法 , 但 因 肽 仅 仅 由 20 种 真核 氨 基 酸 合 成 而 受 限 制 , 筛 选 方 法 也 仅 限 于 结 合 检测 2 。2 分 子 细 胞 水 平 的 特 异 性 体

9、外 筛 选 模 型2. 1 分 子 水 平 的 药 物 筛 选 模 型 这 是 H T S 中 使 用 最多 的 模 型 。 根 据 生 物 分 子 的 类 型 , 分 子 水 平 的 药 物 筛 选模 型 主 要 分 为 受 体 、 酶 、 通 道 、 基 因 和 其 他 类 型 的 模 型 ,其 特 点 是 药 物 作 用 靶 标 明 确 , 应 用 这 些 模 型 可 以 直 接那 些 威 胁 到 生 态 系 统 、 生 境 或 物 种 的 外 来 物 种 ” ; 第 2,要 查 清 我 国 现 有 的 外 来 有 害 物 种 的 种 类 及 危 害 状 况 ;第 3, 要 加 强 对

10、已 知 的 主 要 外 来 有 害 物 种 的 防 治 及 综 合治 理 工 作 。目 前 我 们 所 面 临 的 问 题 并 不 仅 仅 是 食 人 鱼 的 问题 , 而 是 一 个 来 势 凶 猛 的 入 侵 种 问 题 。 就 鱼 类 而 言 , 不会 “ 食 人 ” 的 鱼 有 很 多 也 被 引 进 , 有 些 也 在 野 外 大 量 发现 , 如 罗 非 鱼 、 革 胡 子 鲇 已 在 广 西 , 云 南 等 南 方 地 区 发展 。 南 美 的 甲 鲇 在 台 湾 被 称 为 垃 圾 鱼 , 四 处 可 见 。 微 甘菊 将 吞 掉 伶 仃 岛 、 水 葫 芦 欲 困 死 云 南

11、 滇 池 、 飞 机 草 要 霸占 西 双 版 纳 、 大 米 草 在 毁 掉 海 岸 滩 涂 。 食 人 鱼 向 我们 的 大 众 敲 响 了 入 侵 种 危 害 的 警 钟 : 对 任 何 外 来 物 种 ,都 要 有 较 高 的 警 惕 , 要 有 风 险 意 识 。(BF) 72003 年 第 38 卷 第 3 期 生 物 学 通 报得 到 药 物 作 用 机 理 的 信 息 3 。2. 1. 1 受 体 筛 选 模 型 受 体 筛 选 模 型 典 型 的 是 受 体与 放 射 性 配 体 结 合 模 型 。 其 过 程 一 般 是 让 受 体 、 配 体 、供 试 化 合 物 和 必

12、 要 的 辅 助 因 子 一 起 加 入 到 适 当 的 缓 冲液 中 , 温 孵 一 定 时 间 使 结 合 反 应 达 到 平 衡 , 随 后 通 过 过滤 分 离 结 合 和 游 离 的 配 体 , 然 后 将 滤 纸 烘 干 , 滤 纸 上 残留 的 即 为 结 合 的 放 射 性 配 体 , 这 可 用 液 体 闪 烁 计 数 来测 量 结 合 的 放 射 性 配 基 。2. 1. 2 酶 筛 选 模 型 筛 选 作 用 于 酶 的 药 物 , 主 要 是 观察 药 物 对 酶 活 性 的 影 响 。 根 据 酶 的 特 点 , 酶 的 反 应 底物 , 产 物 都 可 以 作 为

13、检 测 指 标 , 并 由 此 确 定 反 应 速 度 。典 型 的 酶 筛 选 包 括 3 个 部 分 : 1) 让 被 测 化 合 物 在 适 当缓 冲 液 中 孵 化 ; 2) 反 应 起 始 后 (可 以 加 金 属 离 子 或 蛋 白质 激 活 剂 ) 可 以 通 过 改 变 反 应 混 合 物 的 温 度 , 缓 冲 液 的pH 值 和 酶 的 浓 度 来 控 制 反 应 速 度 ; 3) 如 果 是 单 时 间 点数 器 (single2tim e po int) , 反 应 必 须 终 止 , 且 需 测 量 产 物的 增 加 和 底 物 的 减 少 。2. 1. 3 离 子

14、通 道 筛 选 模 型 N egri 和 L lew ellyn 4 (1998)建 立 了 贝 类 动 物 毒 素 的 H T S 方 法 。 其 作 用 靶 标为 钠 通 道 上 的 蛤 蚌 毒 素 (STX ) 结 合 位 点 , 用 放 射 性 配体 (3H STX ) 进 行 竞 争 性 结 合 试 验 考 察 受 试 样 品 。Young5 等 用 酵 母 双 杂 交 的 方 法 H T S 干 扰 N 型 钙 通 道B3 亚 单 位 与 A1B亚 单 位 相 互 作 用 的 小 分 子 , 寻 找 新 型 钙通 道 拮 抗 剂 。2. 2 细 胞 水 平 药 物 筛 选 模 型

15、该 模 型 是 观 察 被 筛 样品 对 细 胞 的 作 用 , 但 不 能 反 映 药 物 作 用 的 具 体 途 径 和靶 标 , 只 能 反 映 出 药 物 对 细 胞 生 长 等 过 程 的 综 合 作 用 。所 以 当 已 知 单 一 确 切 的 与 治 疗 相 关 的 靶 标 后 就 不 适 合于 初 筛 。 这 些 模 型 中 最 重 要 的 是 报 告 基 因 ( repo rtergene)测 定 。 由 于 转 录 因 子 和 基 因 表 达 相 关 因 子 是 药 物作 用 的 重 要 靶 标 , 从 而 出 现 了 报 告 基 因 法 。 如 果 把 靶 基因 表 达

16、的 调 控 序 列 与 编 码 某 种 酶 活 性 的 基 因 相 连 , 转入 细 胞 内 , 通 过 简 单 地 检 测 酶 活 性 的 变 化 , 就 可 以 反 映化 合 物 对 转 录 因 子 和 基 因 表 达 的 作 用 性 质 和 程 度 , 一般 把 这 种 能 间 接 反 映 基 因 转 录 水 平 的 编 码 某 种 酶 的 基因 称 为 基 因 报 告 法 。 在 应 用 时 , 首 先 确 定 构 建 模 型 所 需的 调 控 序 列 , 然 后 根 据 具 体 情 况 选 择 载 体 6 。 应 用 最 普遍 的 有 荧 光 素 酶 基 因 、 B2半 乳 糖 苷 酶 基 因 (B2Cal) 和 氯霉 素 已 酰 转 移 酶 基 因 (CA T )。 除 了 报 告 基 因 法 外 , 还 有细 胞 增 殖 测 定 、 细 胞 基 础 的 生 理 测 定 和 黑