自免试剂盒

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1、美国GenBio公司 英明道(ImmunoDOT)免疫法检验系统之 自身免疫检查试剂盒 说明书 用于体外诊断 产品编号：950-0001-00 25T 950-0002-00 100T 本试剂盒采用酶免疫分析法(EIA)筛查和检测血清或肝素抗凝全血中抗各种特异性核抗原的自身抗体，用于自身免疫性疾病的辅助诊断。本产品适用于临床科室和实验室。 概述1 1948年创建的红斑狼疮(LE)细胞检查为医师提供了一个诊断SLE较为特异的实验室检查项目。近来，检测特定自身抗体存在与否影响着诊断的可靠性。本试剂盒检测对核抗原有特异诊断意义的总抗核抗体和独立的五种常见的核抗原抗体：脱氧核糖核酸(DNA)、干燥综合

2、征抗原A(Ro)、干燥综合征抗原B(La)、核糖核蛋白(RNP)和Smith抗原(Sm)。 原理 本试剂盒是利用酶免疫斑点技术来检测抗体。抗原以分散的点状被固定在固相膜上。将测定标本加入到反应管内，插入测试条，使标本的抗体同固定在测试条固相膜上的测定抗原反应。然后去除非特异的结合物质，再加入结合有碱性磷酸酶的抗人抗体同已固定的人抗体反应，最后将测试条移入酶底物试剂同碱性磷酸酶发生显色反应产生容易观察、明显的斑点。 试剂 测试条 斑点从标记处向下依次为：人的IgG阳性质控、阴性质控、包括纯化的鸡红细胞核和小牛核抗原的总核抗原、双链脱氧核糖核酸(ds-DNA)、Smith抗原/核糖核蛋白(RNP)

3、、干燥综合征A/B抗原。 稀释液(#1) 由缓冲液(pH6.2-7.6)、蛋白稳定剂和0.1%的叠氮钠组成。 增强液(#2) 由含有氯化钠和0.1%的叠氮钠组成。 结合液(#3) 由溶解于缓冲液(pH6.2-8.5)中的与羊抗人抗体结合的碱性磷酸酶、蛋白稳定剂和0.1%的叠氮钠组成。 发展液(#4) 由溶解于缓冲液(pH9.0-11.0)中的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、对硝基氯化四唑兰(NBT)、0.8%N、N-二甲基甲酰胺(DMF)和0.1%的叠氮钠组成。 注意事项 体外诊断使用。本试剂盒是一个完整的分析系统，不能用其它制造商的试剂或其它英明道(ImmunoDOT)免疫法检验系统的试剂

4、来替代，这些替代会影响测试结果。稀释或掺杂试剂也会影响测试结果。不要用过期的试剂盒。清洗液必须是分析级的去离子水或蒸馏水。应仔细阅读操作说明，试验中应保证正确的反应时间。勿缩短或延长孵育时间。 某些试剂中含有叠氮钠，它可与铅、铜反应形成高致密的金属叠氮物。必要时可用大量的水冲洗，阻止叠氮物形成。 注意潜在的生物源性危险。尽管在测试条上采用的抗原是无传染性的，但还应注意。尽管阳性质控的血清通过用FDA所提供的方法来检测抗HIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1抗体及HBV表面抗原是阴性，但没有任何检验方法能完全确保HIV、HBV或是其它传染因子绝对不存在，试验用标本应当作传染性人血清或全血标

5、本处理2。 贮存 试剂和测试条在28贮存。试剂使用前平衡至室温(1530)，若置于加热的专用恒温仪上必须在1小时内使用。应避免因试剂污染导致的错误结果。 标本的采集和处理 本试验用10l血清标本或20l肝素抗凝的全血标本。血清或肝素抗凝的全血按标准法采集。末稍血可室温下稳定一天，血清和肝素抗凝全血在28可储存五天。血清存放在-20以下的可延长储存时间。最好不用冷冻全血。 测定程序 提供物品 测试条 稀释液(#1) 增强液(#2) 结合液(#3) 发展液(#4) 反应管 说明书 自备物品 专用恒温仪 计时器 吸管 吸水纸 标本采集器(如手指采血针、静脉穿刺针) 清洗用的蒸馏水或去离子水 阳性质控

6、血清 预备步骤 1. 将加热块放入专用恒温仪的加热槽，将温度计从盒中取出，取下水银端的塑料护套，水银端向下插入加热块的测温孔，打开专用恒温仪开关，调整温控旋钮(大约在刻度5、6处)至温度计的指示稳定在551(此时反应管的温度为462)。 2. 每份检测需从试剂盒中取出4个反应管分别插入加热块的孔内。 3. 如用9孔专用恒温仪，恒温仪附带的清洗杯中的水要加满至刻度线。如用3孔专用恒温仪，则可用适当容器加上足够的水，水面要能超过测试条上的所有膜孔。 4. 在第一个反应管中加入2ml稀释液(#1)；在第二个反应管中加入2ml增强液(#2)；在第三个反应管中加入2ml结合液(#3)；在第四个反应管中加

7、入2ml发展液(#4)。在进行测试前等待十分钟，以使管内试剂得到预热，这时可以给测试条标号；如果同时作9个标本的试验，应将测试条分别插入支撑架的每个凹槽内，以便操作，注意不要触摸测试条上的膜孔；准备标本。 5. 向稀释液反应管(#1)中加入患者标本(血清10l或全血20l)。 试验步骤 1. 将测试条在清洗杯中预湿30-60秒。 2. 将测试条插入稀释液反应管(#1)中，快速上下运动5-10次，以便混合试剂和标本。放置5分钟。 3. 取出测试条，放入清洗杯中。为使测试条上的膜孔充分清洗，需来回快速运动5-10秒。 4. 将测试条插入增强液反应管(#2)中，快速上下运动5-10次，混合试剂和标本

8、。放置5分钟。 5. 取出测试条，在清洗杯中清洗(同第3步)。 6. 将测试条插入结合液反应管(#3)中，快速上下运动5-10次，混合试剂和标本。放置15分钟。 7. 取出测试条，在清洗杯中清洗(同第3步)。注意不要将测试条从清洗杯中取出。 8. 测试条在清洗杯中放置5分钟。 9. 从清洗杯中取出测试条，插入发展液反应管(#4)中，快速上下运动5-10次，混合试剂和标本。放置5分钟。 10. 取出测试条，在清洗杯中清洗(同第3步)。 11. 显色并等待测试条干燥，对于临界结果必须让测试条在空气中干燥后再判断。 结果判定 阳性：在膜孔中心可见一个清晰而且界限清楚的斑点，膜孔外的周边色必须是白色或

9、灰白色的。 阴性：看不见显色斑点或斑点很浅不易看见。 质量控制 测试条顶端处的两个膜孔用作试剂质控。最顶端是阳性试剂质控，必须显示阳性测定结果才有效；下一个膜孔是阴性试剂质控，必须显示阴性检测结果才有效。试剂质控用来确保在每次分析时所用的各试剂是有效的。如任何一个试剂质控结果有误，则测试必须重做。阳性质控显色斑点的深度不能作为定标物使用。在测试条上的其它膜孔上出现的阳性反应可以比阳性质控显色深或浅，这取决于抗体的滴度。 试验温度是462。专用恒温仪加热块上温度计的指示为551。试验时必须监测温度计的指示，以保证准确的温度。 结果解释 应分别分析测试条的各孔结果。结果通常有三类： 无反应 阴性结

10、果 弱反应 斑点不易识别并被看成阴性结果。 有反应 阳性结果(“斑点”) 弱反应标本有时可见到，有时没有反应。弱阳性结果表示自身抗体水平较低或有存在于正常人体内的非特异性的交叉反应性抗体，这两种情况均可报告有弱阳性自身抗体(低滴度)，但解释时应慎重，因为有相当的正常标本都有类似结果。 局限性 阴性检测结果不能作为单一的标准来排除自身免疫病。没有一个筛选试验能够包含所有可能的核抗原。自身免疫病要结合临床、流行病学及实验室资料来诊断。 除阳性质控孔外任何孔为阳性都表示存在抗核抗体。在某些病例中，可见总ANA滴度低于特异性的抗体。极少数病例会出现相反的结果。某些标本只出现总ANA阳性。少数情况下，仍

11、有一个或多个特异性抗原为阳性，而总ANA为阴性。 预期结果 在主要的系统性风湿疾病中，每种疾病各自显示出相当分明和独特的抗核抗体(ANA)特征模式(如表1)3,4。 表1 ds-DNA Sm抗原 组蛋白 SS-A SS-B RNP Scl-70 核仁 着丝粒 SLE 50-60% 30% 60% 30-40% 15% 30-40% MCTD 90-100% 药物性SLE 95% 弥漫性硬皮病 / / / 10-20% 40-50% CREST综合症 80-90% SS 70% 60% / 关键词： ()高滴度 (%)发生频率 (+/-)偶见低滴度 (-)通常不可见性能特征 用已确诊患者和正常人

12、标本来评价。评价中所使用的患者标本来自临床风湿学医疗中心已确诊有自身免疫病的患者，正常标本还要保证快速血浆凝集(RPR)试验阴性。除阳性质控外，任一孔出现阳性，都可解释为总ANA结果阳性。表2给出了其特性。 本试剂盒能特异地检测五种抗核抗体。为检测试剂的准确性，每个结果都要与标准试验方法相比较，不符合的结果要用商业EIA试验来证实。用短膜虫(Crithidia lucillae)免疫荧光法作为检测ds-DNA自身抗体的标准方法，而Ouchterlony双重扩散试验是其它四种抗体的标准方法。表2为这些结果的总结。为了保证每个独立抗原的特异敏感性，使用的样品分别使用仅RNP或Sm阳性和SS-A或S

13、S-B阳性的样品进行检测。由此得到的独立抗原敏感性为ds-DNA(39/40)，RNP(42/42)，Sm(19/19)，SS-A(73/76)，SS-B(19/20)。 表2 敏感性 特异性 符合率 总ANA 91%(68/75) 99%(116/116) 96% ds-DNA 98%(39/40) 96%(93/97) 96% Sm/RNP 99%(57/57) 90%(142/146) 91% SS-A/B 96%(73/76) 99%(177/177) 99% 参考文献 1. Harley, JB and KK Gaither. Systemic Lupus Erythematosus

14、-Autoantibodies. Rheumatic Disease Clinics of North America 14(1):43 (1988) 2. Centers for Disease Control/National Institutes of Health Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (1983) 3. Nakamura, RM and EM Tan. Autoantibodies to nonhistone nuclear antigens and their clinical

15、 significance. Human Pathology 14(5):392 (1983) 4. Tan, EM. Antinuclear Antibodies in Diagnosis and Management. Hospital Practice 18(1):79 (1983) 生厂商信息 GenBio 15222 Avenue of Science, Suite A San Diego, CA92128 TEL 858.592.9300 FAX 858.592.9400 售后服务单位信息 名称：北京海奥基业生物技术有限公司 地址：北京市海淀区清河镇西三旗东路2号201室 邮编：100096 电话：010-82924623 传真：010-82924624 电邮： 注册产品标准编号：YZB/USA 0174-2005 进口产品注册号：国食药监械（进）字2005第3402145号 阳性质控 阴性质控 总核抗原 双链DNA Smith抗原/核糖核蛋白RNP 干燥综合征A/B抗原 050-0000-01 试验步骤简要说明 自身免疫检测试剂盒 预备 s 设置好恒温仪温度 s 放入反应管 s 在第一个反应管中加入2ml稀释液（#1）；在第二个反应管中加入2ml增强液（#2）；在第三个反应管中加入2ml结合液（#3）；在第四个反应管中