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1、1肺癌患者 PTEN 基因启动子甲基化和转录表达的研究作者：余宗涛 高琼 张吉才 吕军 袁亚莉【摘要 】 目的 探讨张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)启动子CpG 岛甲基化状态和基因表达水平与肺癌发生的关系。方法 用甲基化特异性 PCR 检测 PTEN 启动子 CpG 岛甲基化状态，实时定量PCR 检测 PTEN mRNA 的表达水平。结果 在肺癌组织中 PTEN 基因启动子甲基化的频率为 26.67%(12/45)，在肺正常组织中未发生甲基化(2=7.448,P0.01)。正常组织中 PTEN mRNA 全部表达，肺癌组织中表达缺失率为 22.22%(10/45)，且表达量低于正常肺组织(
2、t=-14.156,P0.05);PTEN 甲基化与其mRNA 表达下降密切相关。结论 肺癌中 PTEN 基因启动子甲基化频率明显升高，其表达普遍下调或缺失，提示 PTEN 启动子甲基可在肺癌发生、发展中起一定作用。 【关键词】 肺癌;PTEN 基因; 启动子;甲基化;表达PTEN 位于染色体 10q2313，含有 9 个外显子和 8 个内含子。PTEN 蛋白是由 403 个氨基酸组成的一条多肽链，其主要结构功能2区位于 N 端，在第 122133 位的氨基酸序列(IHCKAGKGRTG) 符合蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase) 及双特异性磷酸酶催化区的核心基序(HCXXGXGRXG) 是至今为
3、止发现的第 1 个具有磷酸酶活性的抑癌基因1 。PTPase 可使蛋白质中的酪氨酸残基去磷酸，此作用恰好与许多癌基因产物 酪氨酸蛋白激酶(TPK) 的作用相反。而酪氨酸在 TPK 的参与下被磷酸化，在调控细胞生长、分化和癌变方面起重要作用。PTEN 在正常组织中均有广泛表达，但在许多肿瘤组织(如肝癌 )中却都有着很高的缺失率或低表达。目前随着表观遗传学研究的发展，抑癌基因启动子区 CpG 岛的高甲基化已被当作引起转录沉默的普遍机制2 。本研究应用逆转录实时定量 PCR 方法测定 PTEN mRNA 在肺癌组织、肺正常组织及肿瘤细胞株 A549 中的表达，以及在 A549 细胞株采用 5AzaC
4、dR 处理后 PTEN mRNA的表达水平变化，同时观察其启动子甲基化状态，分析基因表达水平与启动子甲基化和肺癌早期诊断、恶性转移及预后评估等的临床关系。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本来源 收集湖北省十堰市太和医院 2005 年 3 月至2006 年 2 月手术切除肺癌新鲜标本 45 例，男 28 例，女 17 例。3年龄 4578 岁，平均 55.3 岁。其中小细胞肺癌(SLLC)8 例、非小细胞肺癌(NSCLC)37 例，全部标本均经病理证实，连同 23 例非癌症肺正常对照组织，-80冰箱保存备用。1.1.2 A549 细胞株培养及药物处理 将对数生长期 A549 细胞制成 5
5、104/ml 细胞悬液， 5%CO2 条件下培养 24 h 后，分别用510-6mol/L 和 510-5mol/L 浓度 5AzaCdR 处理，24 h 后弃去药液并重新更换含新鲜培养液的药液，浓度同前。连续作用 3 d 后弃去药液，用完全培养液继续培养 4 d 后进行实验。用同体积PBS 处理的细胞作为对照组。1.1.3 主要试剂与仪器 Wizard DNA clean up 纯化试剂盒、Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(美国Promega 公司); PCR 试剂( 华美公司);RPMI1640 培养基(GIBCO BRL
6、公司);二甲亚砜(DMSO)、对苯二酚和亚硫酸氢钠、5AzaCdR(美国 Sigma 公司);人肺癌细胞株 A549(武汉大学生物保藏中心);PE7000( 美国 ABI 公司) 。1.1.4 引物合成 PTEN 甲基化引物3 ：5TTTTTTTTCGGTTTTTCGAGGC3，5CAATCGCGTCCCAACGCCG3，扩增片段长度为 134 bp。PTEN 非甲基化引物3：5TTTTGAGGTGTTTGGGTTTTTGGT3，5ACACAATCACAT4CCCAACACCA3，片段长度为 124 bp;PTENmRNA 引物4 ：5AACCCACCACAGCTAGAACT3，5ATACAC
7、ATAGCGCCTCTGAC3，片段长度为 251 bp。GAPDHmRNA 引物5：5GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3，5GAAGATGGTGATGGGATTTC3，扩增片段长度为 226 bp( 北京赛百盛公司 )。1.2 方法1.2.1 组织、细胞 DNA 提取 以经典酚 氯仿抽提法提取组织 DNA，经紫外 260 nm 定量后于-80保存备用。1.2.2 组织、细胞 RNA 提取后立即逆转为 cDNA 按 Trizol操作说明书提取组织及细胞 RNA，提取后溶于无 RNA 酶的双蒸水中，立即用试剂盒 A3500 逆转为 cDNA，-40 保存备用。1.2.3 基因组 DNA 的
8、磺化修饰 基因组 DNA 的磺化修饰参照文献6：取 4 g(总体积为 50 l)基因组 DNA，经变性、碱基修饰、脱盐后回收再脱去磺化基团，用预冷酒精沉淀回收。离心干燥后重新溶于 50 l 去离子水中，置-40备用。1.2.4 甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR) PCR 反应体系：磺化修饰后的基因组 DNA 50100 ng(3 l)，10buffer 3 l，2 5mmol/ L dNTP 3 l，25 mmol/L 氯化镁 3 l，Taq 酶 2 U (1 l)，上下游引物各 2 l(12 pmol)，20 倍 SYBR Green 0.75 l，去离子水补齐至 30 l。置 PE70
9、00 仪进行扩增， 95 变性 3 min;(95 60 s，58 30 s，72 60 s)40，在 72读取荧光值;72延伸 5 min，同时测定其熔点曲线。1.2.5 SYBR Green 实时定量 RTPCR 用无 RNA 酶的双蒸水稀释 cDNA 至 100 l。PCR 反应体系：加入稀释的 cDNA 液5 l，2 mmol/L dNTP 混合液 3 l，25 mmol/L 氯化镁 3 l，逆转录 10 倍缓冲液 3 l，上下游引物(50 pmol/L)各 2 l，Taq DNA聚合酶 2 u，20 倍 SYBR Green 0.75 l，加无核酸酶双蒸水至30 l。置于 PE700
10、0，按(95 60 s;58 60 s，7260s)10，再(95 30 s，58 30 s，7260 s)30，在 72 读取荧光值，72延伸 5 min，同时测定其熔点曲线。1.2.6 PTEN mRNA 相对定量计算方法 利用检测得到的 Ct值和计算得到的扩增效率，以 GAPDH mRNA 的量为参照，计算PTEN mRNA 的相对量。PTEN mRNA/GAPDH mRNA 用下述公式计算：(1+EGAPDH)Ct(GAPDH)/(1+EPTEN) Ct(PTEN)7 。1.3 统计学分析 用 SPSS10.0 软件分析，甲基化率统计比较用卡方检验，相对定量比较用两独立样本均值的 t
11、检验。62 结 果2.1 PTEN 甲基化结果 在全部 45 例经亚硫酸氢钠处理的基因组 DNA 标本中，有 5 例(其中 SCLC 2 例)只存在甲基化 PCR 产物，另外 40 例标本都存在非甲基化 PCR 产物，其中既有甲基化又有非甲基化产物的 7 例 (其中 SCLC 0 例)，只检测出非甲基化产物33 例，其甲基化频率为 26.27%(12/45);而在 23 例正常对照组织中，未检出甲基化存在，两组差异显著(2=7.448，P0.01)。2.2 PTEN mRNA 相对定量 正常组织中，PTEN mRNA 的Ct 均值为 15.05，而 GAPDH mRNA 的 Ct 均值为 14
12、.65，相对比值 0.880.12;在肺癌标本中 PTEN mRNA 的相对比值均值0.310.23，两组差异显著(t=-13.156,P0.001)。在检出甲基化的 12 例肺癌组织中，8 例(包括 5 例完全没有未甲基化产物检出的标本)PTEN mRNA 低于检测下限(即在 40 个循环后还没有出现 Ct值);在 A549 细胞株中，PTEN mRNA 相对定量为 0.50;但用5AzaCdR 处理后，其 PTEN mRNA 相对定量达到 0.80。2.3 PCR 产物分析 经 2%琼脂糖凝胶电泳 2 h 证实了是一条特异的目的带(见图 1图 3)。PTEN 甲基化与非甲基化的熔点温度见图
13、 4，PTEN mRNA 表达 SYBR Green实时定量 PCR 曲线见图5。73 讨 论抑癌基因 PTEN 的抑癌作用是通过作用于磷酯酰肌醇 (PI)30H 激酶 (PI3 K) 的下游靶分子 PIP3 来阻断 PI3 KPKB/ Akt (蛋白激酶 B) 信号通路而起作用的8 。PIP3 可以作为特定细胞生长刺激因子的内部信使，细胞生长刺激因子与细胞膜的受体结合PI3 K，通过在信使的前体 PIP23OH 磷酸化生成 PIP3，PIP3 依次激活信号通路上其他激酶，激活细胞进入分裂周期进程或阻止细胞凋亡的发生。而 PTEN 使 PIP2 向 PIP3 的转化发生逆转，抑制了PIP3 激
14、酶的磷酸化。因此阻断了 PKB/ Akt 及其下游激酶的活性，从而导致细胞增殖抑制和细胞凋亡。PTEN 基因在肿瘤中发生突变、丢失、启动子异常甲基化后，可能会导致 PIP3 通路异常激活，对肿瘤细胞的负调控作用受到抑制，允许本应死亡的细胞无节制生长。本实验组用 SYBR Green 实时定量 PCR 研究了 PTEN 在45 例肺癌组织中的转录表达，其表达缺失率高达 22.22 %(10/ 45)，且即使表达其表达量显著降低;而在相对应的正常组织中几乎全部正常表达，两者的表达差异显著;但病人的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤的病理类型差异不显著。说明 PTEN 的表达缺失是肺癌发生过程中的早期事件，
15、并确立 PTEN 为肺癌的候选抑癌基因。笔者利用MSPCR 和 SYBR Green 实时定量 PCR 对肺癌组织 PTEN 启动8子存在甲基化的标本进行筛选。数据显示，在肺癌中，26.67%的病例标本中存在 PTEN 基因启动子区域 CpG 位点甲基化，而正常对照组织中，存在甲基化的未检测出，二者之间的差异有统计学意义(2=7.448,P0.01) 。在被检出的 PTEN 甲基化的标本中有 8 例PTEN mRNA 未检测出，缺失率高达 66.67%。表明在肺癌组织中，PTEN 基因启动子区域确实存在 CpG 位点被甲基化的现象。A549肺癌细胞株检测甲基化阳性 PTENmRNA 较低，但用5AzaCdR 处理后 PTENmRNA 相对定量显著增高，根据已被广泛证实的启动子区域 DNA 甲基化胞嘧啶的密度和基因转录活性的相互关系9 ，证实启动子区域 CpG 位点甲基化是 PTEN 失活的主要机制，在肺癌的发生过程中发挥主要作用。甲基化与非甲基化熔点温度比较发现，甲基化的熔点温度比非甲基化的熔点温度平均高约 35( 图 4)，这是由于基因组 DNA的磺化修饰，MCpG 没被转化，而未被甲基化的 CpG 被转化，C被转化为 T，熔点温度降低。熔点温度差异不同，证明甲基率(并不是所有的 CpG 岛均被甲基化)
