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1、1肥胖小鼠内脏与皮下脂肪 Visfatin 基因表达作者：林纬 刘小莺 周文娟 林益川 郑培烝 刘礼斌【摘要 】 目的 观察肥胖对小鼠内脏脂肪和皮下脂肪组织Visfatin 基因表达的影响。 方法 高脂饮食喂养刚断乳雄性c57BL/6 小鼠 8 周，诱导营养性肥胖模型。8 周后，筛选肥胖小鼠,普通饲料组作为正常对照，实时荧光定量 RTPCR 方法检测Visfatin 的基因表达，分别进行 Visfatin 基因表达与体质指数、内脏脂肪组织含量及体脂指数相关性的分析。 结果 肥胖组小鼠内脏脂肪组织 Visfatin 表达明显升高，是对照组的 4.76 倍（95 可信区间为 3.686.15,P0
2、.05） 。 结论 Visfatin 在营养性肥胖 c57BL/6 小鼠内脏脂肪组织中高表达暗示了它可能在肥胖的发生发展中发挥重要的作用，肥胖可能是导致Visfatin 基因表达升高的原因之一。 【关键词】 肥胖症 细胞因子类 脂肪组织 疾病模型 动物Visfatin 是 Fukuhara 等于 2005 年发现的一种脂肪因子,与先前在淋巴细胞中发现的一种称为前 B 细胞克隆增强因子（PreB cell colonyenhancing factor，PBEF ）的免疫蛋白结构一致，由2于其主要由内脏脂肪组织分泌产生，因此将之命名为 Visfatin，即内脏脂泌素1。国外研究表明，Visfati
3、n 可结合并激活胰岛素受体,模拟胰岛素作用,从而降低血糖；还能够促进脂肪组织的分化、合成及储积1。因此，它很可能是与糖尿病和肥胖有关的一个肽类激素。本研究拟通过高脂膳食筛选肥胖的 c57BL/6 小鼠，通过荧光实时定量 RTPCR 方法检测肥胖小鼠内脏和腹部皮下脂肪组织 Visfatin 基因表达的影响。1 材料与方法1.1 实验动物及饲料配制 （1 ）选用健康、雄性、出生 21 d 左右的 c57BL/6 小鼠，体质量 8.510.0 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供许可证号：SCXK( 沪)20030003 。 （2 ）普通饲料：玉米粉 30，豆饼 21.0，麸皮 10.0，次粉
4、28.0，鱼粉 9.0，酵母粉 1.0，鱼肝油 1（g/100 g）等。高脂饲料：猪油 12.0，奶粉 8.0，鸡蛋 10.0，花生 5.0，麻油 3.0，以普通饲料补足 100 g 混成含 12猪油的高脂饲料2 ，食用前 2 d 配好，低温保存。1.2 动物模型的制备 将 39 只 c57BL/6 小鼠适应性喂养 1 周后，按随机数字法随机分为 2 组：对照组 10 只，喂普通饲料；实验组 19 只，喂高脂饲料。自由饮水，每日早晚 2 次喂食（昼夜比31212）, 食后不再添加，共饲养 8 周。每周称体质量 1 次。8 周后，以体质量超过（x 对照组体质量 2 s）作为肥胖标准,筛选出营养性
5、肥胖小鼠 10 只（10/19）作为肥胖组。1.3 标本收集及处理 实验结束后，自由饮水，禁食 12 h 后以 3戊巴比妥钠，45 mg/kg 腹腔注射麻醉。下腔静脉采血，室温静置 4 h，3 000 r/min 离心 10 min，分离血清，-70 保存待测。迅速摘取肾脏周围、肠系膜周围、附睾周围以及腹部皮下（肋弓以下腹股沟以上，两侧以腋中线为界）的脂肪组织，称取湿质量。所取脂肪组织立即装入无 Rnase 的 Eppendorf 管，用液氮速冻，-70 保存备用。1.4 检测方法 体长：从 c57BL/6 小鼠鼻尖到肛门的长度（cm） ；体质指数，即 Lees 指数=体质量（g）103/体长
6、（cm） ，脂肪垫总质量（g ）肾脏周围脂肪组织附睾周围脂肪组织；体脂指数=脂肪垫总质量（g）湿质量（g ） 。血脂测定：胆固醇(TC)为胆固醇氧化酶法；甘油三酯(TG)为 GPO 酶法，试剂购自美国 Beckman 公司；高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白 (LDL)均为酶法检测，试剂购自英国 Randox 公司，由美国 Bckman Cx7 全自动生化分析仪检测。1.5 Visfatin mRNA 检测 Trizol(Invitrogen)法提取脂肪组4织总 RNA。依据逆转录试剂盒（ A3500,Promaga）说明操作，获得 cDNA 后，用无 RNase 的 DNase（Proma
7、ga）处理，去除可能的基因组 DNA 污染，再进行实时荧光定量 PCR 扩增。36B4(NM007475)为内参照基因，其引物（136 bp)：上游：5AGTGCTCGACATCACAGAGCA3 下游：5GCGCTTGTACCCATTGATGA3 Visfatin（NM021524 ）为目的基因，其引物 (101bp)：上游：5TCATTCAAGGAGATGGCGTG3下游：5ACCAGAACCGAAGGAGACATTC3实时荧光定量 PCR 反应体系：SYBRR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）10.0 L，0.2 mol/L 上下游引物各1
8、.0 L，模板(RT 产物 12 稀释)2.0 L，总体积为 20.0 L；以NTC（no template control） 、NRTC（no reversetranscript control）为阴性对照。反应条件：95 10 min95 30 s60 1 min（signal） ，6095 20 min（测定熔解曲线） ，仪器为德国 Roche 公司的 Light Cycle RealTime PCR 仪，结果由仪器配套的软件分析，采用比较阈值法来测定目的基因的相对表达3：5目的基因的量2-CtCt=(Ct 目的基因Ct 内参基因) 实验组(Ct 目的基因Ct内参基因)对照组2-Ct 表
9、示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于内参基因的定量。1.6 脂肪组织 Visfatin 和 36B4 扩增反应的效率 将对照组所提取的总 RNA 逆转录成的 cDNA，按 11、110、1100 稀释后，同样条件下进行实时定量荧光 PCR 反应，以 cDNA 稀释倍数的对数为横坐标，目的基因 Ct 值与内参基因 Ct 值的差值为纵坐标，可得一直线，测得斜率为：0.0521（R2 0.9756） ，接近 0，故可认为内参基因 36B4 与目的基因 Visfatin 扩增效率接近一致，可采用比较阈值法（图 1） 。1.7 统计学处理 上述实验各样
10、品均重复 3 次。数据用 xs表示，SPSS 11.5 软件处理数据，采用单因素方差分析，Pearson相关分析。2 结果62.1 体质量、体质指数、血脂、血糖及内脏脂肪量 与对照组相比，肥胖组小鼠体质量、体脂指数、血总胆固醇、LDLC、HDLC 和血糖及内脏脂肪量均升高（P0.01 ） ，但血TG 较对照组降低（P0.05） （表 1，2） 。图 1 扩增效率曲线示意图（略）Fig 1 Amplification efficiency curv2.2 内脏及腹部皮下脂肪组织实时定量 PCR 结果 肥胖组小鼠 Visfatin 基因表达明显升高,是对照组的 4.76 倍（95 可信区间为 3.
11、686.15, P0.05） ，无明显升高（表 34，图 2） 。2.3 相关性分析 内脏脂肪组织 Visfatin 基因表达与体质指数（r=0.584,P=0.011） 、内脏脂肪组织含量(r=0.676,P=0.002)及体脂指数(r=0.704,P=0.001)均呈正相关，而腹部皮下脂肪组织Visfatin 基因表达水平与上述指标均无明显相关性。3 讨论7局部脂肪分布,尤其是过多腹部脂肪堆积是冠心病、高血压、高脂血症、糖尿病的重要危险因素，其中腹腔内脏脂肪组织与胰岛素抵抗关系最为密切46 ，其次为腹部皮下脂肪组织。本研究中所建立的营养性肥胖 c57BL/6 小鼠模型，其腹腔内脏脂肪组织湿
12、质量、腹腔内脏脂肪组织含量、体脂指数及内脏脂肪组织量/腹部皮下脂肪组织量均较对照组显著增加（P0.01 ） ，此特征更符合人类 2 型糖尿病和代谢综合征相关的腹型肥胖的特点，适合于研究肥胖与 2型糖尿病及代谢综合征之间的相关性。表 1 对照组与肥胖组 c57BL/6 小鼠血清指标比较（略）Tab 1 Blood serum indexCHOL：胆固醇； TG：甘油三酯；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白. 与对照组组比较，：P0.01.表 2 对照组与肥胖组 c57BL/6 小鼠脂肪组织相关指标比较（略）Tab 2 The index of adipose tissueVFAT：内脏脂
13、肪组织总量；SFFAT ：皮下脂肪组织总量. 8与对照组比较，：P0.01.表 3 内脏脂肪组织实时定量测定结果（略）Tab 3 The realtime quantitative results of abdominal visceral adipose tissue与对照组比较，：P0.01.表 4 皮下脂肪组织实时定量测定结果（略）Tab 4 The realtime quantitative results of abdominal subcutaneous adipose tissueA、C 为扩增曲线，B、D 为熔解曲线. A、B 为内脏脂肪组织；C、D 为皮下脂肪组织 .图 2
14、内脏与皮下脂肪 36B4 与 Visfatin 基因扩增曲线与熔解曲线（略）Fig 2 Amplified curve and melting curve of 36B4 and Visfatin9本研究结果显示，营养性肥胖组 c57BL/6 小鼠内脏脂肪组织Visfatin 基因表达显著增高，是对照组的 4.76 倍(P0.01) ，而皮下脂肪组织却无明显改变，暗示 Visfatin 可能在肥胖的发生发展中发挥重要的作用，肥胖可能是导致 Visfatin 基因表达升高的原因之一。这与 Fukuhara 等的研究结果相一致1。然而，Visfatin 的许多特征仍表明该因子对于了解内脏脂肪和皮下
15、脂肪不同生物学特性以及它们对于代谢综合征的不同影响具有重要意义。首先，Visfatin主要由内脏脂肪组织分泌，其水平与内脏脂肪量相关而与皮下脂肪无关。其次，高脂饮食诱导的肥胖能够增加内脏脂肪组织 Visfatin基因表达的事实表明它在饮食或者肥胖诱导的胰岛素抵抗中扮演着重要的角色。可见 Visfatin 是一种主要由腹部脂肪分泌的，沟通内脏脂肪过度膨胀和胰岛素抵抗的独特的脂肪因子。虽然，Fukuhara等清晰地阐明 Visfatin 的内分泌效应，然而，尚不能排除 Visfatin也可能具有对内脏脂肪组织的旁分泌效应，通过促进脂肪细胞的分化，从而促进脂肪合成、储积1。事实上，在前脂肪细胞系过表达的 Visfatin 能够促进前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，并且通过激活糖的转运和脂肪的合成，促进脂肪的累积。第三、Visfatin 对脂肪组织的作用通过其定位于细胞内（胞质和胞核）而进一步证实，暗示了其在细胞周期调节中的作用7，进一步支持了 Visfatin 对脂肪组织有直接效应。因此，Visfatin 可能具有双重的作用：一方面，通过自分泌或旁分泌效应
