《抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定作者：汪治华, 张国成*, 许东亮, 孙 新, 李小青, 李思袖, 张学红, 聂晓晶, 豆玉凤【摘要 】 目的: 构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库, 搭建人源性抗体制备的技术平台, 为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、 诊断、 治疗和预防提供新的有效途径。方法: 从 52 例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总 RNA, 并逆转录为 cDNA。用 PCR 扩增轻链和重链 Fd 段（即重链的可变区和第一恒定区）基因, 并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pComb3x 噬粒载体, 电转化 XL1Blue 大肠杆菌, 经辅
2、助噬菌体M13K07 超感染后构建成 Fab 段噬菌体抗体库。对此抗体库双酶切进行鉴定, 并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选。结果: 经过重轻链基因的重组, 成功构建一免疫噬菌体抗体基因库, 共有2.6106 个不同的克隆菌, 其中 70%的克隆均含有轻链和重链 Fd 基因。因此, 所构建的噬菌体抗体库的库容量为 1.8106, 经初步筛选, 抗体库得到了不同程度的富集。结论: 利用基因重组技术和噬菌体展示技术, 成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库, 为进一步的研究奠定了基础。 2【关键词】 抗体库; 噬菌体展示技术; Fab 抗体; 呼吸道合胞病毒; 儿童随着分子
3、生物学的发展, 基因工程抗体技术的出现 , 尤其是噬菌体抗体库技术, 为各种不同免疫原人源性抗体的制备提供了新途径, 成为抗体工程领域革命性的进展1 。我们以 52 例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞作为基因来源, 成功地构建了一个人源性 Fab 段免疫噬菌体抗体库, 并对其进行了初步鉴定, 为研制诊断、治疗和预防小儿呼吸道病毒感染的基因工程药物奠定了基础, 同时也将解决鼠源性抗体在临床应用中存在的不足。1 材料和方法1.1 材料 选取 52 例经 ELISA 法检测呼吸道合胞病毒 IgM 和/或 IgG 抗体阳性的患儿, 每例患儿抽取血液 2 mL, 共约 100 mL。噬粒载体 pCo
4、mb3x（含氨苄青霉素抗性基因）, 大肠杆菌菌珠 XL1Blue（带四环素抗性基因）, 辅助噬菌体 M13K07(具卡那霉素抗性基因)由第四军医大学李郁博士惠赠。焦碳酸二乙酯购自AMRESCO 公司, TRIzol 购自 Invitrogen 公司, RNA 逆转录试剂盒购自 Fermentas 公司, Taq DNA 聚合酶和 T4 DNA 连接酶购自TaKaRa 公司, 限制性内切酶 Spe I、 Xho I、 Sac I、 Xba I 购自3Promega 公司, 呼吸道合胞病毒 Long 株（RSVLong ）, 由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 淋巴细胞的分离和总 RNA 的提
5、取 用淋巴细胞分离液分离约 100 mL 外周血淋巴细胞, 用 TRIzol 法提取总 RNA, 取适量进行甲醛变性胶电泳并用分光光度计测 A 值以鉴定 RNA 的质量。1.2.2 轻链基因和重链 Fd 段基因的扩增 PCR 引物设计及扩增参照文献2, 共 23 条引物, 由 Generay Biotech 公司合成。按RNA 逆转录试剂盒中的说明 , 将总 RNA 逆转录为 cDNA, 以其为模板, PCR 扩增轻链及重链 Fd 段基因, 扩增条件为: 94 50 s, 55 50 s, 72 1 min, 共 30 个循环; 并分别引入酶切位点 Sac I+Xba I 和 Spe I+Xh
6、o I。将全部抗体基因产物经琼脂糖凝胶电泳回收。1.2.3 轻链基因库和 Fab 段抗体基因库的构建及鉴定 轻链基因的扩增产物经 Sac I 和 Xba I 双酶切后回收, 与经同样酶切回收的pComb3x 载体片段相连接 , 并电转化 E.coli XL1Blue 感受态菌, 构建轻链基因库。取适量菌液稀释后, 接种于 SOBAG 琼脂平板（含氨苄青霉素 100 mg/L, 葡萄糖 20 g/L）, 以测定转化率, 并随机挑选 10 个单克隆菌, 酶切鉴定轻链库的重组率。其余菌液扩大培4养后提取质粒, 经 Spe I 和 Xho I 双酶切, 回收带有多样性轻链基因的载体大片段; Fd 段重
7、链基因也以 Spe I 和 Xho I 双酶切后回收, 用 T4 DNA 连接酶将回收的两种基因片段连接, 将连接产物电转化E.coli XL1Blue, 其余构建 Fab 段抗体基因库步骤同轻链基因库的构建。1.2.4 Fab 段噬菌体抗体库的构建及初步筛选 将 Fab 段抗体基因库的菌液转入 SBA+T+液体培养基（含 100 mg/L 氨苄青霉素和10 mg/L 四环素）中 37振荡培养 2 h, 然后按 11012pfu/100 mL 加入辅助噬菌体 M13K07 和卡那霉素（终浓度 70 mg/L）, 于37培养过夜。次日, 将扩大培养的菌液于 4 以 4 000 r/min 离心
8、15 min, 加入 40 g/L PEG8000 沉淀, 用含有 10 g/L BSA 和100 g/L 甘油的 PBS 重悬沉淀, 瞬时离心, 取上清即为噬菌体抗体库。用纯度为 11015/L 的 Long 株 RSV 颗粒作抗原进行初步筛选, 将 RSV 包被于 96 孔板于 4过夜, 次日, PBS 洗涤后, 用 30 g/L BSAPBS 封闭, 于 37孵育 1 h。将上述噬菌体抗体库溶液加入96 孔板于室温孵育 1 h 后倒空, 用含 0.5 mL/L Tween 的 PBS 洗涤10 次后, 再用 PBS 洗涤 10 次。加入对数期生长的 E.coli XL1Blue 和 M1
9、3K07, 于 37孵育 2 h 以让其再感染和进行噬菌体挽救, 并测定抗体库的滴度, 其测定方法为: 将抗体库按比例稀释后取 1 L 与 100 L 对数期生长的 XL1blue 菌液混合, 37缓慢振荡反应 20 min, 加入 Top Agar 3 mL, 铺至 37预热不含抗生5素的 LB 琼脂平皿, 37 培养过夜, 计算平皿上噬斑形成单位（pfu） 。重复上述淘筛过程 3 遍。每轮筛选完毕后均按如下过程对抗体库进行 ELISA 检测: 将 100 L RSV 包被于 96 孔板 4 过夜; PBS 洗涤后于每孔加入 10 L 待测噬菌体抗体, 并用含 20 g/L 脱脂奶的 PBS
10、于室温封闭 2 h; 加入 HRP抗 M13 抗体孵育 1 h; 用 PBST 洗涤 5次, 加入 ABTS 置室温 30 min 后测 A 值。2 结果2.1 淋巴细胞的分离和总 RNA 的提取 提取的总 RNA 凝胶电泳显示条带完整, A260/A280 值为 2.03, 说明提取的总 RNA 质量较好(图 1)。图 1 总 RNA 凝胶电泳分析2.2 轻链基因和重链 Fd 段基因的扩增 取适量轻链基因和重链Fd 段基因的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 在约 700 bp 处均可见扩增条带, 与预期的大小相符（图 2） 。2.3 轻链基因库和 Fab 段基因库的构建及鉴定 从轻链基因库 14
11、mL 转化产物中取 1 L 稀释后铺于琼脂平板上, 共长出 205 个单克隆菌落, 从而推算转化子数为 20514103=2.9106; 随机挑取的10 个菌落的质粒经 Sac I 和 Xba I 双酶切后电泳, 其中有 8 个可得6到 700 bp 左右 DNA 片段, 为轻链基因插入片段, 重组率为 80, 则其库容量为 2.91060.8=2.3106。用同样的方法 , 得到 Fab抗体基因库转化子数为 2.6106, 随机挑取的 13 个克隆中有 9 个酶切出 Fd 段 DNA 片段, 则重组率为 9/13(约 70) （图 3）, 则其库容量为 2.61060.7=1.8106。2.
12、4 Fab 段噬菌体抗体库的构建及初步筛选 以 RSV 作为抗原对噬菌体抗体库进行了 3 轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选, 测定抗体库滴度分别为 1.2105、 1.8106、 9.4106 pfu, 显示了明显增加的趋势, 第 3 轮比第 1 轮增加了 78 倍, 说明特异性噬菌体得到了富集; 每轮均经 ELISA 检测, A 值分别为 0.23、 0.56、 1.05, 随着筛选轮数的增加而逐渐增加。3 讨论呼吸道合胞病毒感染在儿科很常见, 每年均有暴发, 发病率高, 90%在 2 岁前均感染过 RSV3, 但目前尚无理想的抗病毒药物。1891 年, Emil von Behring 首次将
13、来自动物的白喉抗毒素血清用于白喉感染患儿的治疗取得较为满意的疗效, 从而为抗体用于感染性疾病的治疗奠定了基础4 。杂交瘤技术的创立 , 为 mAb 用于感染性疾病的治疗提供了可能, 但是鼠源性的 mAb 因 HAMA 反应等副作用而受限于临床应用5 。噬菌体抗体库技术的出现 , 首次为获7得完全人源性的 mAb 提供了一条佳径。噬菌体展示技术是一种分子多样性技术, 它让大量不同的多肽或蛋白展示在丝状噬菌体的表面6 。针对几乎任何抗原的高亲和力特异性抗体均可在噬菌体抗体库中筛选出, 使 mAb 用于肿瘤、 感染性疾病等的诊断、 治疗成为可能7, 8 。与费时而繁杂的 mAb 技术相比, 噬菌体抗
14、体有稳定的基因来源, 可以通过 DNA 重组, 迅速而经济地制备各种人源性抗体而无动物免疫原性, 从而适合体内诊断与治疗9 。有两种途径可以获得高亲和力的抗体, 一种是构建大容量的天然抗体库, 另外就是构建免疫抗体库10 。从免疫抗体库中获得的抗体其亲和力较从天然抗体库中获得的要高, 而且无交叉免疫源性。我们选用呼吸道合胞病毒感染患儿的淋巴细胞作为基因来源, 将减少抗体的多样性, 但可以从相对较小库容的抗体库中获得高亲和力特异性抗体。通过初步鉴定, 我们所构建的抗体基因库库容量为1.8106, 经过 3 轮淘筛, 特异性 Fab 抗体得到较好的富集。因此 , 我们成功构建了一免疫噬菌体抗体库,
15、 为后续的实验和进一步研究打下了良好的基础, 也将有益于小儿呼吸道合胞病毒感染的诊断、 治疗和预防。【参考文献】 1 Hoogenboom HR, de Bruine AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its applicationsJ . 8Immuno Technol, 1998, 4(1): 1-20. 2 李晓琳, 侯宗柳, 刘建生, 等. 超大容量非免疫人源性 Fab抗体库的构建J. 云南医药, 2006, 27(2): 94-97.3 Ogra PL. Respiratory syncytial
16、virus: the virus, the disease and the immune responseJ. Paeditr Respir Rev, 2004, 5(2): 119-126.4 何 维. 医学免疫学M. 北京 : 人民卫生出版社, 2006: 24-48.5 Hughes D. Therapeutic antibodies make a comebackJ. Drug Discovery Today, 1998, 3(10): 4396 Clackson T, Lowman HB. Phage displayA practical approachM. Oxford University Press Uk, 2004: 15-28.7 Binyamina
