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1、1左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的抗氧化作用及其机制研究【摘要】 目的：观察左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的保护作用，探讨其作用机制。方法：健康雄性 Wistar 大鼠 40 只，随机分成 4 组：假手术组、生理盐水对照组、左卡尼汀 100 mg/kg 治疗组及左卡尼汀 200 mg/kg 治疗组，每组 10 只。采用线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型，缺血 2 h，再灌注 24 h，观察左卡尼汀对脑组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响，HE 染色观察大鼠脑组织的病理改变。结果：左卡尼汀可明显减少 MDA 的含量，升高 SOD 活性，同生理盐水对照组相比，P0.01。结论：左卡尼汀
2、对脑缺血再灌注损伤有保护作用，与提高脑组织中抗氧化酶活性、抑制氧自由基产生及脂质过氧化反应有关。 【关键词】 左卡尼汀;脑缺血再灌注;丙二醛;超氧化物歧化酶Abstract Objective：To investigate the protective effects of levocarnitine on cerebral ischemiareperfusion(I/R)injury in rats and analyze the mechanism of action of levocarnitine in preventing and treating ischemic cerebrov
3、ascular disease.Methods：Forty healthy male wistar rats were randomly allocated into four 2groups：sham operation group，salinecontroled group，treated with 100 mg/kg of levocarnitine group and treated with 200 mg/kg of levocarnitine group，each of ten rats.The models of the focal cerebral I/R rats were
4、made by the middle cerebral artery occlusion(MCAO)except shamoperation group.After ischemia for 2 h and reperfusion for 24 h，malondialdehyde(MDA)levels and superoxide dismutase(SOD) activity were measured in the cerebral tissues.The pathological feature of cerebral tissue was detected by HE staining
5、.Results：Levocarnitine injection significantly suppressed MDA levels，prevented reduction of SOD activity in comparison with the salinecontroled group(P0.01).Conclusion：The results demonstrated that levocarnitine has a potent neuroprotective effect against cerebral I/R induced injury to enhance the a
6、ctivity of the antioxidant system and decrease the incidence of free radicalinduced lipid peroxidation in rat brain.Key words levocarnitine;cerebral ischemia reperfusion;malondialdehyde;superoxide dismutase本实验通过观察左卡尼汀对大鼠脑缺血再灌注脑组织超氧化3物歧化酶(SOD) 和丙二醛(MDA)水平的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤的保护作用及可能的作用机制，为临床应用左卡尼汀治疗脑梗死提供
7、理论依据。1 资料与方法1.1 动物与试剂选健康雄性 Wistar 大鼠(山西医科大学生理实验室提供)40只，鼠龄 34 个月，体重 200250 g。注射用左卡尼汀(珠海亿邦制药有限公司，批号：20090102);SOD 和 MDA 试剂盒(南京建成生物研究所);普通试剂由山西医科大学实验中心提供。1.2 方法1.2.1 实验分组及给药方法40 只 Wistar 大鼠，随机分为假手术组(A 组)、对照组(B 组) 、左卡尼汀 100 mg/kg 治疗组(C 组)、左卡尼汀 200 mg/kg 治疗组(D 组)，每组 10 只。B 组制作模型前 30 min 予生理盐水 1 mL 腹腔注射;C
8、 组、D 组制作模型前 30 min 分别以 100 mg/kg、200 mg/kg 左卡尼汀腹腔注射。41.2.2 大鼠局灶性脑缺血(MCAO)再灌注模型制作用改良 Longa 法1建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。将大鼠用 10%水合氯醛 3 mL/kg 腹腔麻醉，颈正中右旁开0.51 cm 切口，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉、颈总动脉近心端，在颈总动脉距离分岔口大约 5 cm处用眼科剪剪开一小口，将直径 0.236 mm 的进口鱼线插入，以分岔口处开始测量距离，插入 1.82 cm 后固定鱼线，缝合。缺血 2 h 后将线栓拉出 1 cm 左右即可，形成再灌注
9、。其中假手术组插入1.0 cm 鱼线，其余步骤同实验组。神经功能缺陷评分按照 Longa等1的 5 级 4 分法标准。1.2.3 脑组织病理切片的制备及 MDA 和 SOD 含量的测定各组大鼠缺血 2 h 再灌注 24 h 后行神经功能评分后颈椎脱臼处死，在冰盘上快速取脑，置 04 生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，各组随机取 2 只大鼠右侧脑组织迅速固定，石蜡包埋后，在海马部位做矢状切片，厚约 5 m，HE 染色，观察组织学变化。剩余右侧脑组织加入 9 倍量的 04生理盐水，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成 10%的脑匀浆，3 000 r/min 离心 15 min，取上清液检测 MDA 和 S
10、OD。严格按试剂盒说明书步骤要求操作，计算出5MDA 和 SOD 含量。1.2.4 统计学方法采用 SPSS13.0 软件包，数据以s 表示，采用单因素方差分析进行统计学处理。P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 光镜下 HE 染色结果A 组大脑皮质及海马神经细胞形态基本正常。B 组神经细胞变性坏死明显，胞体肿胀，周围间隙增宽，结构不清，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。C、D 组神经细胞呈轻度缺血改变，变性坏死不明显，胞体呈轻度肿胀，神经细胞缺失较 B 组轻。2.2 各组脑组织 MDA、SOD 含量比较与 A 组比较，B 组 3 种 ATP 酶的活性均明显降低，差异有统计学意
11、义。C 组、D 组与 B 组比较差异有统计学意义。C 组与 D 组比较 SOD 活力差异有统计学意义(见表 1)。表 1 左卡尼汀对大鼠脑缺血再灌注后脑组织 SOD、MDA 含量的影响63 讨 论脑缺血再灌注后导致缺血区自由基增多，过多的自由基与脑组织生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应2，使脑组织生物膜受到损伤，从而引起细胞水肿、损伤直至死亡。MDA 是脂质过氧化产物之一，其含量间接反映了细胞受自由基攻击的脂质过氧化程度，是目前公认的判别脂质过氧化的参数指标。SOD 是体内最有效的氧自由基清除剂，对机体的氧化与过氧化平衡起着至关重要的作用，通过清除超氧阴离子自由基后保护神经细胞免受损伤。
12、MDA、SOD 活性高低可间接反映机体清除自由基的能力。左卡尼汀又名左旋肉碱，是存在于机体组织内的一种特殊氨基酸，其基本生理功能是转运脂肪酸进入细胞线粒体，通过 氧化进入三羧酸循环，为细胞提供能量。近年来发现左卡尼汀在体外和动物模型对治疗细胞缺血 再灌注损伤方面具有自身的优势和特点，是一类有效的细胞缺血 再灌注损伤的治疗药物。研究表明左卡尼汀通过阻断缺血性脑损伤病理生理机制的多个环节而发挥脑保护作用3，且通过新型有机阳离子转运蛋白 2 很容易通过血脑屏障4。Gokhan 等5在四血管闭塞造成短暂性脑缺血模型中，左卡尼汀降低脑组织 MDA，提高 SOD、谷胱甘肽、海马 CA1 和 CA3 区神经
13、元细胞数，表明左卡尼汀具有抗氧化性清除氧自由基的作用。Xie和 Zeng6用含有左卡尼汀的 KH 液灌注心脏，发现左卡尼汀组7ATP、SOD 和糖原水平均增加，MDA 、乳酸脱氢酶和肌酸磷酸激酶浓度下降，认为左卡尼汀对缺血再灌注有保护作用，可能是其防止能量损耗和抗氧化作用。此外，左卡尼汀通过维持线粒体通透性转换通道，保持线粒体呼吸链的正常功能，阻止线粒体自由基的产生，对神经细胞产生保护作用7。在低氧情况下，左卡尼汀通过激活转录活化因子 Nrf2 的表达，刺激产生大量的抗氧化基因和促进血红素加氧酶的分泌;通过激活酪氨酸 A(TrkA)受体，扩大 Nrf2 抗氧化的能力，降低自由基生成、脂质过氧化
14、和蛋白质氧化，提高谷胱甘肽的水平，从而起到抗氧化保护神经细胞的作用8。本实验建立大鼠脑缺血再灌注模型，结果显示，生理盐水对照组大鼠再灌注 24 h 后脑组织 SOD 活性较假手术组显著下降，而MDA 含量显著升高，表明脑缺血再灌注后自由基大量生成，同时机体的自由基防御系统如 SOD 等抗氧化物功能受损，不能有效清除自由基，自由基大量堆积并攻击富含磷脂的细胞膜，使膜结构破坏，细胞肿胀坏死，脑组织发生脂质过氧化损伤，功能受损。而左卡尼汀治疗组与生理盐水对照组比较，脑组织 SOD 活性相对升高，MDA 含量明显下降，说明左卡尼汀能清除自由基，提高脑组织中SOD 活力，减轻脂质过氧化损伤，进而减轻再灌
15、注损伤，保护神经细胞功能。综上所述，左卡尼汀是一种有效的氧自由基清除剂，对脑缺8血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与增加自由基清除酶 SOD活性，抑制脂质过氧化反应，降低 MDA 含量有关。左卡尼汀属内源性物质，安全性高，不良反应发生低，目前临床上已广泛应用于透析、心绞痛、充血性心力衰竭、心源性休克等患者的治疗。本实验证实左卡尼汀能有效地清除脑缺血再灌注后的自由基，对缺血再灌注损伤的神经细胞产生保护作用，是一种有效的脑保护剂。因此，在目前对缺血性脑血管疾病尚无特效治疗措施的情况下，左卡尼汀的治疗作用值得进一步探讨。【参考文献】1Longa E Z，Weinstein P R，Carlson
16、S，et al.Reversible middle cerebral artery occulusion without craniectomy in rats J.Stroke，1989，20：8491.12 王锐，李光来，成学恭.通窍健脑胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤后SOD、MDA 及线粒体酶的影响 J.中西医结合心脑血管病杂志，2005，3(3)：234236.13Zanelli S A，Solenski N J，Rosenthal R E，et al.Mechanisms of ischemic neuroprotection by acetylLcarnitineJ.Ann N Y Acad Sci，2005，1 053：153161.14Inano A，Sai Y，Nikaido H，et al.AcetylLcarnitine permeability acr
