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1、1实时定量逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者术前外周血 CK20 mRNA和 CEA mRNA的临床意义作者：周海茵，葛成华，王世伟，叶古祥，唐文贤，赵旭鸿，范珍妮【摘要 】 目的 探讨大肠癌患者外周血 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 的表达及其临床意义。方法 采用实时定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR ）技术，对 68 例大肠癌患者及 30 例健康志愿者（对照组）术前外周血 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 水平进行检测。结果 在对照组中 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 均无表达，而在大肠癌组中 CK20 mRNA 阳性表达率为 45.6%，CEA mRNA 阳
2、性表达率为 39.7%，二者联合检测阳性率为 55.9%，较单项检测阳性率高（P0.05） ，二者的表达与性别、肿瘤部位和肿瘤分化程度无明显相关，与肿瘤临床分期、淋巴结转移和肝脏转移明显相关。结论 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 可作为大肠癌细胞血行播散的标志，联合检测有助于提高肿瘤微转移的检出率及判断预后。 【关键词】 大肠肿瘤；微转移；外周血 Abstract Objective To investigate the expression of CK20 mRNA and CEA mRNA in peripheral blood of patients 2with colorec
3、tal cancer and its clinical significance.Methods CK20 mRNA and CEA mRNA were detected in 68 patients with colorectal cancer before operation,30 health adults by QRT-PCR.Results CK20 mRNA and CEA mRNA were undetected in the control group,the positive rate of CK20 mRNA among colorectal cancer patients
4、 was 45.6%,and of CEA mRNA was 39.7%.The positive rate of combination detection was 55.9%.It was higher than the rate of detection alone.There was no statistically significant difference of positive rate between two detection methods.The expression of CK20 mRNA and CEA mRNA were not significantly co
5、rrelated with sex of patients,the place of the tumor or differentiation level of cancer cells,but correlated with clinical stage,lymph nodes metastasis and liver metastasis.Conclusion CK20 mRNA and CEA mRNA were useful maker of blood dissemination of colorectal cancer cell and the positive rate of m
6、icrometastasis be maybe raised by combination detection.The expression of CK20 mRNA and CEA mRNA may be regarded as a reference indicator. Key words colorectal cancer;micrometastasis;peripheral blood3大肠癌是我国发病率较高的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年升高趋势，其术后复发及远处转移率达 20%45%1 。因此早期检测出循环癌细胞对判断肿瘤复发和转移及指导临床综合治疗有重要意义2 。1 对象与方法1
7、.1 研究对象 68 例大肠癌患者选自 2007 年 1 月2008 年 3月在我院接受手术治疗并经病理确诊的患者，男 39 例，女 29 例，年龄 2688 岁，中位年龄 65 岁。临床分期：期 6 例，期 24例，期 27 例，期 11 例。肿瘤分化程度：高分化腺癌 26 例，中分化 28 例，低分化 11 例，未分化 3 例。对照组 30 例健康志愿者来自同期我院健康职工。1.2 仪器与试剂 定量 PCR 仪（美国生物应用公司 ABI7500） ，Trizol 试剂（上海闪晶分子生物科技公司） ，CK20 mRNA 和 CEA mRNA PCR 试剂盒（上海达为科生物科技公司） 。1.3
8、 RNA 提取 采集对照组及大肠癌组患者术前肘静脉血 5 ml（草酸钾抗凝） ，1 h 内用淋巴细胞分离液分离有核细胞，将分离的有核细胞收集到 1.5 ml 离心管中，12 000 rpm 离心 5 min,弃上4清，在沉淀中加入 Trizol 500 l,混匀置室温 10 min，加入氯仿200 l 混匀，4 10 000 rpm 离心 5 min，吸取上层水相于 1.5 ml 离心管中，并加入 2 倍体积预冷异丙醇混匀，置 -20 冰箱 20 min，4 10 000 rpm 离心 10 min（以沉淀 RNA） 。弃上清，用预冷 75%酒精（DEPC 处理水配制）500 l 漂洗一次，4
9、 10 000 rpm 离心 10 min，弃上清，留沉淀，充分吸尽残留液， 65 干式恒温器，干燥 10 min，20 l DEPC 处理水融解 RNA,-80 保持待用。1.4 逆转录反应制备 cDNA 标本处理后的 RNA 70 预变性 5 min，迅速置于冰浴以防 RNA 复性，反应体系的配制方法： RT 反应液 18 l，M-MLV 逆转录酶 1 l，RN asin 1 l 加入离心管中混匀，在每个反应管中加入 20 l 上述反应液，加入预变性的 RNA 5 l，37 水浴 60 min，95 预变性 5 min，以灭活 M-MLV 逆转录酶。1.5 PCR 扩增反应 每管取 PCR
10、 反应液 43 l，Taq 酶 2 l 加入总无菌离心管中混匀，每个反应管中加入 45 l 上述反应液，加入RT 反应液 5 l，95 预变性 5 min，95 变性 15 s，60 退火30 s，60 延伸 30 s，共 40 个循环，最后 72 延伸 10 min；根据所获得的标准曲线得到各检测标本的浓度（copies/ml） 。51.6 结果判断 以 RNA 浓度1.0103 copies/ml 为阳性，1.0103 copies/ml 阴性3 。1.7 统计学处理 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 阳性率用百分率表示，采用 EXCEL 软件统计，率的比较用 2 检验，P0.05
11、 为差异有统计学意义，P0.01 为差异有显著统计学意义。2 结果2.1 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 的表达 大肠癌组中 CK20 mRNA 阳性者的水平为（11 055.951 649.61）copies/ml，CEA mRNA 阳性者的水平为（12 664.362 990.17）copies/ml。CK20 mRNA 和 CEA mRNA 在各组中表达列于表 1。表 1 显示大肠癌组 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 的阳性率分别为45.6%（31/68）和 39.7%（27/68） ，对照组中 CK20 mRNA 和CEA mRNA 的阳性率均为 0，大肠癌组 CK
12、20 mRNA 和 CEA mRNA 的阳性率之间差异无统计学意义（P0.05） ，CK20 mRNA和 CEA mRNA 的阳性率在大肠癌组与对照组之间差异有显著统计学意义（P0.01） 。表 1 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 在各组中的表达2.2 联合检测阳性率（至少一项阳性）与单项阳性比较 大肠癌6组中联合检测阳性率 55.9%（38/68）较 CK20 mRNA 45.6%（31/68）与 CEA mRNA 39.7%（27/68）单项检测的阳性率有明显升高，但与单项比较差异无统计学意义（P0.05） 。2.3 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 的表达与大肠癌临床病
13、理因素的关系 表 2 显示 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 的阳性表达在患者性别、肿瘤部位及分化程度之间比较差异无统计学意义，CK20 mRNA 和 CEA mRNA 的阳性表达在肿瘤临床病理分期之间比较差异有统计学意义（P0.05） ，CEA mRNA 的阳性表达在淋巴结是否转移的患者之间比较差异亦有统计学意义（P0.05） ，而 CK20 mRNA 的阳性表达在淋巴结是否转移的患者之间比较差异有显著的统计学意义（P0.01） ，CK20 mRNA 和 CEA mRNA 在肝脏有无转移患者阳性表达的比较差异有显著的统计学意义（P0.01） ，可见肿瘤分期越晚，淋巴结和肝脏转移者其阳
14、性表达率越高。表 2 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 阳性表达与肿瘤临床病理因素的关系3 讨论大肠癌的复发和转移与其他恶性实体肿瘤一样，以微转移为基础和前提，然而常规检测方法不能有效检测出微循环中的癌细胞和微转移灶，因此术前不能及时发现微转移，不利于肿瘤的正确分期及治疗方案的制定，术后不能及时发现复发及转移，以致不能更好地改善预后和延长生存期4 。随着 PCR 技术的不断发展，实时7定量 PCR（QRT-PCR）技术能从 106107 个细胞中检出 1 个肿瘤细胞，该技术具有敏感性高、特异性强、简单快速的优点，使外周血肿瘤微转移的检测成为可能5 。近年来细胞角蛋白家族成员作为检测微转
15、移的指标备受关注6 。细胞角蛋白是上皮细胞骨架的主要成分，表达于正常上皮细胞、上皮细胞原发性肿瘤及其转移肿瘤细胞。CK20 具有组织特异性，其局限于胃肠上皮细胞，在正常骨髓、血液和淋巴结中均无表达，而几乎全部胃大肠肿瘤均明显表达，且侵袭、转移、扩散到其他器官时始终保持稳定7 。CEA是一种特异性较高的肿瘤相关抗原，大约 95%的大肠癌有 CEA 基因表达。因此根据 CK20 与 CEA 的分布特点使其成为特异的大肠癌的肿瘤标志物及微转移检测指标。Funaki 等8 、Xu 等9利用RT-PCR 技术检测大肠癌患者外周血微转移癌细胞，发现大肠癌复发和转移者 CK20 mRNA 均为阳性，并且随
16、Dukes 分期的进展CK20 mRNA 的表达水平增加。钟平来等10 发现直肠癌患者外周血 CEA mRNA 表达阳性率与远处转移有明显相关性，对术后的判断具有较高的可信度，本实验支持上述观点。本研究结果显示 68例大肠癌患者外周血 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 的阳性表达率分别为 45.6%和 39.7%，显示微转移在近 40%的大肠癌患者中存在，联合检测阳性率为 55.9%，较单项为高，虽然差异没有统计学意义，但联合检测有助于提高检出率。同时本研究还显示，CK20 mRNA和 CEA mRNA 的阳性表达率均与肿瘤临床病理分期、淋巴结转移和肝脏转移相关，而与性别、肿瘤生长部位、肿瘤分化程度无明显8相关，这表明肿瘤分期越晚，肿瘤释放入循环血中的癌细胞越多，CK20 和 CEA 的表达阳性率越高，复发和转移的几率越大，预后越差，亦提示
