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1、1大鼠颈动脉球囊损伤后平滑肌细胞mTORP70S6K表达作者：朱政 孙守刚 许广莉 王琼英 白锋【摘要 】 目的 探讨姜黄素对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖体蛋白质 S6 激酶(P70S6K)在血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法 54只雄性 SD 大鼠随机分为对照组、损伤组和药物干预组。颈动脉 HE染色和组织病理图像分析;免疫组织化学观察 PCNA 与 P70S6K 组织表达中的病理变化;实时定量 PCR 检测 mTORP70S6K 及 PCNA的 mRNA 表达;ELISA 测定血清白介素18(IL18) 水平变化。结果 实验术中死亡大鼠 1 只，取材过程中发现动脉闭塞 5 只(分别为 3
2、d药物干预组和 7 d 损伤组各 1 只，14 和 28 d 药物干预组各 2 只)。 HE 染色显示 14 d 药物干预组与损伤组相比内膜与中膜增殖厚度明显减低，组织图像分析三组之间内膜厚度差异无统计学意义，而中膜厚度差异具有统计学差异(P=0.000);免疫组化结果示对照组与损伤组及药物干预组存在差异(P=0.045);实时荧光定量 PCR mTORP70S6K 及 PCNA 的 mRNA 损伤组与对照组相比具有统计学意义(P0.05);ELISA 示与对照组相比姜黄素能抑制第3、7 、14 天药物干预组血清 IL18 浓度，具有统计学意义 (P 均0.05)。结论 姜黄素能够抑制 IL1
3、8、mTORP70S6k 及PCNA 在损伤血管平滑肌细胞中的表达，并能抑制平滑肌细胞增殖，2可能成为预防再狭窄的新药物。 【关键词】 姜黄素;血管平滑肌细胞; 白介素18; 雷帕霉素靶蛋白;核糖体蛋白质 S6 激酶近年来，心血管病特别是冠心病的高发病率、高致残率和高死亡率给社会及居民造成沉重负担。经皮冠脉介入(PCI)已成为治疗冠心病的最有效手段之一，但是其长期获益受到了血管再狭窄的限制，Odell 和 Garg 等1，2研究表明，支架植入术后 9 个月再狭窄率为 5%8%以上。药物涂层支架使再狭窄率明显下降，但晚期支架内血栓引起了人们的关注3 。尽管临床上给予 PCI 术后双联甚至三联抗血
4、小板药物，但再狭窄仍是支架置入术后预防的重点和难点。球囊机械损伤，冠脉再狭窄的主要原因是由于血管平滑肌细胞(VSCM)的异常增殖、迁移和纤维化。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种主要成分，其通过下调 P13K/Akt 通路抑制 VSMC 增殖与迁移。姜黄素已用于生物可吸收支架，对 PCI 术后再狭窄及支架内血栓起到抗增殖及预防作用4 。目前国内对雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)、核糖体蛋白质 S6 激酶 (P70S6K)与白介素18(IL18) 和再狭窄关系研究未见相关文献报道。本实验在于讨论姜黄素是否能够通过降低mTORP70S6K 及 IL18 的表达，从而降低 PCI 术后再狭窄的发生。31 材
5、料与方法1.1 主要药物及试剂 98%高效液相色谱姜黄素购于陕西森弗生物技术公司;IL18 ELISA 试剂盒及 RNA 纯化试剂 Trizol 分别购于美国 ADL 公司与 Invitrogen 公司;RTPCR 反转录试剂盒和 PCR试剂盒购于日本 Toyobo 公司;PCNA 和 P70S6K 抗体购于美国BioworlD 公司，免疫组化二抗试剂盒购于中国武汉博士德公司。1.2 实验方法1.2.1 动物分组及模型 54 只(78 周龄)无特殊病原体(SPF)级雄性 SD 大鼠由甘肃中医学院动物实验中心提供，体重 (30050)g。动物批号：scxk( 甘) 20040006。随机分为对照
6、组(假手术组)6只，损伤组与药物干预组(损伤加药物) 各 24 只，又分别分为3、7 、14 及 28 d 组。戊巴比妥钠 40 mg/kg 腹腔麻醉后，尾静脉给予肝素 100 U/kg。颈前正中切开皮肤及皮下组织，动脉夹分别夹住颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉剪一楔形切口，插入 2 F(220 mm)球囊 (Medtronic，美国)，注入生理盐水 0.2 ml 使其膨胀，缓慢回拉球囊至平切口处，抽出球囊内液体，重复上述过程三次，退出球囊，结扎颈外动脉，恢复血流。庆大霉素 40 万 U 冲洗切口后缝合皮下组织及皮肤。青霉素 40 万 U/d 肌肉注射，连续 3 d。普通饲料喂养，自由饮水。对照
7、组仅切开皮肤分离皮下组织，不插入4球囊，药物干预组给予姜黄素 100 mgkg-1d-1 灌胃。取材：所有动物分别在第 3，7，14 和 28 天麻醉后取全血及左侧颈总动脉后脱臼处死。全血 4 000 r/min 离心 20 min 取上清-20冰箱保存;颈总动脉经肝素生理盐水冲洗后分两等份，40 g/L 甲醛固定和液氮保存。1.2.2 IL18 检测 ELISA 按试剂盒操作说明进行操作。1.2.3 组织病理(HE)及图像分析及免疫组织化学 将病理标本在 40 g/L 中性甲醛液中固定 24 h 后，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(片厚 5 m)。对病理切片行免疫组化染色，观察受损血管
8、组织形态学改变、同时采用计算机全自动图像分析系统测定受损血管内膜与中膜厚度。1.2.4 实时定量 PCR1.2.4.1 引物设计与合成 根据 Genbank 提供的基因序列及引物设计原则应用 Primer Premier 5 和 Oligo 6 引物设计软件，自行设计引物，由北京三博远志公司合成。mTOR 正链5GAATCAGACAGGCACGAAGG3，反链 5TCTTCTTCCAGCAAGTTCAGC3;P70S6K 正链5AAAGAAGAGGAAGCTGT3，反链55CTTTAAGTGTCCCATGTCAG3;PCNA 正链5AAAGAAGAGGAAGCTGT3，反链 5CTTTAAGT
9、GTCCCATGTCAG3;actin 正链5TTGCTGATCCACATCTGCTG3，反链5GACAGGATGCAGAAGGAGAT3。1.2.4.2 Trizol 法抽提总 RNA 与 cDNA 合成 将 100 mg 血管研成匀浆，加入 Trizol 1.0 ml，室温静置 5 min;加入氯仿 1/5 体积，4 12 000 g 离心 15 min，抽取上清约 500600 l，加入异丙醇 500 l 混匀，-20 过夜; 过夜后 4 7 500 r/min 离心 10 min，弃上清，无水乙醇 1 ml 洗涤 2 次，4 7 500 r/min 离心 5 min，弃上清，室温放置
10、25 min，加 DEPC 水 30 l，立即逆转录(根据试剂盒说明书进行) 或保存液氮中。1.2.4.3 PCR 反应步骤 PCR 反应体系为 25 l，包括蒸馏水5.5 l;SYBR Green12.5 l;Plus solution 2.5 l;上下游引物各 1 l;cDNA 2.5 l。变性 95 15 s，退火 57 15 s，延伸 72 45 s，共 40 循环。1.3 统计方法处理 所有资料以 xs 表示，组间数据比较采用方差分析;秩和检验分析等级资料，应用 SPSS11.0 软件包进行统计学分析。62 结 果2.1 各组血清 IL18 结果 见表 1。第 3、7 天损伤组及药物
11、干预组 IL18 水平较对照组明显增高(P0.05)，第 14 天损伤组高于对照组(P0.05)。第 3、7、14 天药物干预组较损伤组低(P0.05) 。2.2 HE 及免疫组织化学 对照组光镜下内皮细胞和内弹力膜完整，中层 VSMC 呈梭形，胞核小而扁。损伤组损伤后 7 d 光镜下管腔面有较完整的扁平内皮，增生的内膜呈均匀性或非均匀性增厚，有迁移的 VSMC 和少许纤维组织形成 ;损伤后 14、28 d 光镜下内膜明显增厚，VSMC 由中膜向内膜大量迁移并增生，细胞排列紊乱，中膜明显增厚，管腔狭窄。药物干预组新生内膜中的 VSMC 较同期对照组明显减少，内皮较完整、光滑，内膜增生较轻。P7
12、0S6K 的免疫组织化学在不同时间段增殖程度不一致，损伤组在第 7 和 14天增殖最为明显，细胞核染成棕褐色，着色细胞数明显多于对照组及药物干预组，图 1，图 2，表 2，表 3。表 1 各组血清 IL18 表达变化(xs，ng/ml，n=6)与对照组比较：1)P0.05;与损伤组比较：2)P0.05;下表同表 2 大鼠颈动脉球囊损伤后不同时间段内膜与中膜厚度变化(xs，mm ，n=6) 表 3 大鼠颈动脉球囊损伤后免疫组织化学 P70S6K不同组间 VSMC 增殖程度等级(n=6)72.3 实时定量 PCR 组织总 RNA 质量及纯度检验，每份样品其 A260/A280 nm 吸光度比值均在
13、 1.72.0 之间。建立最佳实时定量 PCR 条件后，采用 SYBR Green 两步法应用 IcycLer iQ(Biorad USA)型实时定量 PCR 仪，经过与管家基因(actin) 校正后，得出目的基因产物量的变化，见表 4，表 5。表 4 大鼠颈动脉球囊损伤后组织 P70S6k mRNA 表达变化(xs ，ng/ml ，n=6)表 5 大鼠颈动脉球囊损伤后组织 mTOR mRNA 表达变化(xs，ng/ml，n=6)3 讨 论VSMC 增殖迁移是再狭窄的主要因素。目前，姜黄素抑制VSMC 增殖的机制并不清楚，Ingolfsson 等5 认为其可能是通过细胞膜脂质双分子层介导机制与
14、多种膜蛋白共同发挥作用。姜黄素能够作用于多种细胞的靶蛋白如 cmyc、NFkB 、Akt 和PKC。AKT1 能激活 mTOR 通路，并最终增加蛋白转录正向调节者P70S6K，同时抑制真核转录起始因子 4E(eIF4E)的负调节者 eIF4E结合蛋白(4EBP1)。活化的 P70S6K 磷酸化 40S 核糖体的 S6 蛋白，最终上调核糖体蛋白 mRNA 转录及延伸因子的水平。P13KAktmTOR 信号通路是 PCI 术后平滑肌增殖的信号蛋白，应用 mTOR 特异性抑制剂雷帕霉素可以抑制 PCI 术后血管的再狭窄，8并且在雷帕霉素中掺入姜黄素后能够明显降低支架内晚期血栓形成，表明其在血管再狭窄
15、中发挥着重要作用68 。体外研究表明，姜黄素抗血栓机制是通过诱导二磷酸腺苷(ADP)、肾上腺素和胶原而抑制血小板聚集，并且上调前列腺素合成而发挥作用9 。在应用雷帕霉素涂层支架中掺入姜黄素能够明显的改善雷帕霉素支架的血液相容性，降低 VSMC 增殖和支架内晚期血栓形成 6 。细胞因子类家族 IL18 与 IL1 等在起始机制、受体结构及信号转导通路都是相关的。资料显示血清 IL18 水平与 PCI 术后血管再狭窄成正相关10 。IL18 抑制剂 IL18 结合蛋白能够阻断动物模型颈动脉球囊损伤 IL18 诱导的平滑肌增殖11 。本实验表明，姜黄素能够抑制血清 IL18 从第 3 到 14 天的
16、表达。研究表明 IL18 可通过氧化应激与 NFkB 信号通路诱导平滑肌细胞增殖与迁移12，13 。基因表达水平的相关分析发现 mTORP70S6k 的表达量与 VSMC 的细胞增殖关系密切。但 IL18 与 mTORP70S6k 表达量是否相关还未见报道。本实验结果示，姜黄素能够抑制损伤诱导的 VSMC 的增殖，可能经 mTORP70S6k 信号通路和 IL18 炎性因子来发挥作用。从成本效益来看，广泛使用支架相对于 PCI 而言尽管其减少了此后的血运重建，但并没减少长期的住院费用1 。与当前常用支架如雷帕霉素涂层支架和紫杉醇涂层支架药物相比，姜黄素容易获得，提取及合成成本较低14 ，其制成药物支架有利于减低成
