《余甘子提取物体外抗单纯疱疹病毒1型和2型的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《余甘子提取物体外抗单纯疱疹病毒1型和2型的初步研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1余甘子提取物体外抗单纯疱疹病毒 1 型和 2 型的初步研究作者：瞿畅，赖志才，裴赢，张美英，王一飞，张颖君，杨崇仁【摘要 】 目的从余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物3 种提取物体外筛选抗单纯疱疹病毒 1 型和 2 型的活性成分。方法通过观察药物毒性、病毒引起的细胞病变效应、空斑减数法，判断药物的毒性及其抗病毒效应。结果余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物对于单纯疱疹病毒 1 型的半数抑制浓度分别为25.28，66.17，100.94 g/ml;余甘子的 3 种提取物对于单纯疱疹病毒 2 型的半数抑制浓度分别为 31.70，180.3，112.1 g/ml。结论余甘子 3 种提
2、取物在体外对单纯疱疹病毒 1 型和 2 型均有一定的抑制作用。 【关键词】 余甘子 ; 单纯疱疹病毒 1 型; 单纯疱疹病毒 2 型; 细胞病变效应法; 空斑减数法Abstract：ObjectiveTo study the active components of anti- HSV-1 and HSV-2 of crude extract from Phyllanthus emblica. MethodsThe toxic and antivirous effects were evaluated by observing toxic effect, cytopathic effect(C
3、PE), 2MTT colorimetric assay for vital cell rate, plaques reduction ratio. ResultsInhibition on herpes simplex virus were observed during the experiment. The IC50 on HSV-1 of acetic ether extract, methanol extract,aqueous extract from Phyllanthus emblica were 25.28, 66.17, 100.94g/ml; while the IC50
4、 on HSV-2 of the extracts above were 31.70, 180.3, 112.1g/ml.ConclusionThe three extracts from Phyllanthus emblica can inhibit both of HSV-1 and HSV-2 in vitro.Key words： Phyllanthus emblica; HSV-1; HSV-2; CPE; Plaques reduction ratio单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 属于疱疹病毒科 病毒亚科，呈球形，完整病毒由核心、衣壳、被膜(Tegume
5、nt)及囊膜组成。单纯疱疹病毒 1 型主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官;单纯疱疹病毒 2 型主要感染腰部以下粘膜，是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首。对于疱疹病毒的感染，临床主要使用阿昔洛韦、更昔洛韦等药物进行治疗。但此类药物的缺点是极易产生耐药的现象，国内外许多实验室都已成功分离了阿昔洛韦的耐药株1，2 。因此开发出新的抗病毒药物成为研究病毒药物的热点。3我国是一个中药资源很丰富的国家，本课题的研究目的就是从已经证明有抗病毒活性的南药中筛选出具有抗病毒的活性成分，并且在前期的研究中也有了一些发现36。余甘子为大戟科叶下珠属植物余甘子的果实，又称庵摩勒、油
6、柑子、滇橄榄。余甘子味甘、微涩，性凉，有清热利咽、润肺止咳的功用，其药用价值早在我国古代药膳异物志 唐本草 本草拾遗及本草纲目中就有论述。余甘子在临床上主要用于感冒发热、咽喉痛、咳嗽、口干、烦渴、牙痛、维生素 C 缺乏症。本研究探讨余甘子对两种单纯疱疹病毒的作用。1 材料仪器1.1 药物余甘子晾干果实的 3 种提取物均由中国科学院昆明植物研究所提供。提取方法：植物样品 (100 g)，粉碎，醋酸乙酯提取，甲醇提取，热水提取，依次得到醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物。醋酸乙酯提取物、甲醇提取物用二甲基亚砜 (DMSO)溶解至 1 mg/ml，水提物用水溶解至 1 mg/ml，高压灭菌待用。1.
7、2 细胞株和病毒株非洲绿猴肾细胞 (以下称 Vero 细胞)购于美国 ATCC 公司，由本室保存。细胞生长液为含 10% 胎牛血清的DMEM，细胞维持液为含 2% 新生牛血清的 DMEM，常规加入青4霉素 100 Mml-1，链霉素 100 Mml-1。Vero 细胞用生长液连续传代 3 次保持对数生长期供实验用。单纯疱疹病毒 1 型 (以下称HSV-1) 毒株 F 株 和单纯疱疹病毒 2 型( 以下称 HSV-2)毒株 HSV-2333 由武汉大学医学院病毒研究所提供。HSV-1 和 HSV-2 的宿主细胞均为 Vero 细胞。1.3 器材和试剂 5%CO2 细胞培养箱，德国 HERAES
8、公司产品; 超净工作台，苏州净化设备公司产; 进口 96 孔培养板(平底)和进口 24 孔培养板(平底)，美国 CORNING 公司产;倒置显微镜，德国 LAICA 公司产;培养基为 DMEM， GIBCOBRL 公司产，除菌过滤后用碳酸氢钠调 pH 至 7.07.2;胎牛血清、新生牛血清，杭州四季青，经 56 30 min 灭活补体，除菌分装 ;消化液为 5 %胰蛋白酶 5 ml + 5 % EDTA 2 ml + 0. 0l mol/ L (pH 7. 2) PBS 93 ml，除菌分装，低温保存;维持液为含 2% 小牛血清的 DMEM 培养基;阳性对照药物阿昔洛韦 (ACV，无环鸟苷)
9、购于湖北科益药业股份有限公司。2 方法2.1 病毒滴度测定使用前在 Vero 细胞中连传 3 代，活化病毒，用维持液将制备好的毒株作 10 倍系列稀释， 10-110-10，常规方法感染单层 Vero 细胞，每个浓度设 8 个复孔，同时设正常细胞5对照。37，5 %CO2 培养。每天在显微镜下观察记录细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。当细胞病变不再发展时，用 Reed-Muench7公式计算半数细胞感染量 (median tissue culture infective dose, TCID50 )。2.2 细胞毒性测定 Vero 细胞经胰酶消化后，制成浓度为2.01
10、05/ml 的细胞悬液，接种于 96 孔板，每孔 100l，37 ，5 %CO2 培养 24h。待其长成单层，弃去培养液。用维持液将 6 种提取物制成系列不同浓度的药液，加入到培养板中，每孔 100l，每个浓度设 4 个复孔，同时设正常细胞对照组、阳性对照组，置 37，5%CO2 培养箱里培养 48 h，其间置倒置显微镜下观察，观察药物的最大无毒浓度。2.3 药物抗 HSV-1 病毒的药效学实验 (空斑减数法)Vero 细胞经胰酶消化后，制成浓度为 1.0106/ml 的细胞悬液，接种于 24孔板，每孔 1 ml，37，5 %CO2 培养 24h。待其长成单层，弃去培养液。将不同浓度药物和病毒
11、稀释液 (40 万倍稀释) 各 100l 混合后加入细胞中，设 4 个复孔，设阳性对照组、病毒对照组和正常细胞对照组，37，5%CO2 培养箱孵育 2 h，加入由 2 倍的 DMEM 维持液和 1% 羧甲基纤维素以 11 的比例配成的完全覆盖液 1 ml。继续培养 72 h 后，弃去覆盖液，10%甲醛固定 10 min，1% 结晶紫染色 30 min，用清水漂洗、晾干，参照 Nitta86的方法清点空斑数，计算空斑抑制率。空斑抑制率 (% ) = (病毒对照组空斑数- 药物处理组空斑数 )/(病毒对照组空斑数)100%。以药物浓度的对数值做横坐标，以空斑抑制率做纵坐标作图，根据空斑抑制率结果作
12、出病毒对药物的敏感性曲线，由此得出药物的半数抑制浓度 (50% inhibiting concentration, IC50 )，实验重复 3 次。2.4 药物抗 HSV-2 病毒的药效学实验(CPE 法)Vero 细胞经胰酶消化后，制成浓度为 2.0105 的细胞悬液，接种于 96 孔板，每孔 100 l，37，5 %CO2 培养 24 h。待其长成单层，弃去培养液。将不同浓度的药液和病毒悬液各 50 l 混合后，加到培养板中，每个浓度设 4 个复孔，同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组。置 37， 5%CO2 培养箱里培养 48 h，其间置倒置显微镜下观察 CPE(见图 1)。待病
13、毒对照组的细胞病变达到 75%及以上时，观察并记录各样品各浓度的细胞病变情况，实验重复 3 次。3 结果3.1 病毒滴度测定按 Reed-Muench 法计算病毒滴度：HSV-1 的 TCID50 为 10-6. 5，即接种滴度为 10-6. 5 的病毒每孔100 l，可使 50 %细胞明显病变;HSV-2 的 TCID50 为 10-7.0，即接种滴度为 10-7.0 的病毒每孔 100l，可使 50 %细胞明显病变。7这两种病毒在实验中所使用的病毒滴度均为 100 TCID50。3.2 细胞毒性测定以正常细胞无自然蜕变、不引起细胞病变的最高药物稀释浓度为对 Vero 细胞的最大无毒浓度 T
14、C0，余甘子的乙酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物的 TC0 分别为：125， 250， 500 g/ml。从以上结果可看出，余甘子的 3 种提取物对细胞的毒性较小。3.3 药物抗 HSV-1 病毒的药效学实验(空斑减数法)在细胞毒性实验结果的基础上，各样品从 125 g/ml 的浓度进行空斑减数实验的测定。通过空斑减数实验，计算得各样品的空斑抑制率以及IC50 值。结果见表 1。表 1 3 种提取物对 HSV-1 的空斑抑制率和IC50 值3.4 药物抗 HSV-2 病毒的药效学实验(CPE 法)在细胞毒性实验结果的基础上，各样品从最大无毒浓度开始进行药效学的测定。并且按照 CPE 观察的结果
15、，计算出各样品的 IC50 值。结果见表2。表 2 3 种提取物对 HSV-2 的抑制效果和 IC50 值CPE 等级：025 %为(+);26 %50 %为(+);51 %75 %为(+);76 %100 %为(+);HSV-2 对照组：(+);细胞对照组：-;未做浓度：/8A病毒对照 B正常细胞对照 C阳性对照(阿昔洛韦，3.2 g/ml) D余甘子醋酸乙酯提取物，125 g/ml E余甘子甲醇提取物，250 g/ml F余甘子水提物，250g/ml图 1 各实验组细胞培养图4 讨论本研究分别通过空斑减数法和 CPE 法测定了余甘子的 3 种提取物抗单纯疱疹病毒 1 型和 2 型的作用。从
16、表 1 和表 2 的结果可以表明，余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物对这两种病毒都有良好的抑制作用。其中以醋酸乙酯提取物的效果最好，对HSV-1 和 HSV-2 的半数抑制浓度 IC50 分别是 25.28，31.7 g/ml。余甘子富含单宁、有机酸、酚类等9。近年来，许多对于单宁类物质的研究表明，它不仅具有良好的抗氧化、抗肿瘤的作用，对于艾滋病毒、乙肝病毒、单纯疱疹病毒等多种病毒均有良好的抑制作用1014。美国食品药品监督管理局(Food and Drug 9Administration，FDA)于 2006-10-30 批准 Veregen TM 成为处方药。它是 50 年来第 1 个被批准在美国上市销售的复合成分植物药，用于具有免疫能力的 18 周岁以上的外生殖器和肛周疣 (尖锐湿疣)患者。其所含药物组分为 kunecatechins，是
