第六章核酸的分离与纯化

第六章 核酸的分离与纯化第一节 核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括 DNA 与 RNA 两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein） 。DNA 与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein， DNP） ，RNA 与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP） 。其中真核生物的 DNA 又有染色体 DNA 与细胞器DNA 之分。前者位于细胞核内，约占 95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占 5%，为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒 DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA 的存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。DNA 分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的 DNA 大约由3.0×109 个碱基对（ base pair, bp）组成，与 5 243bp 的猿猴病毒（simian virus 40, SV40）相比，其长度约为后者的 5.7×105 倍。相对来讲，RNA 分子比 DNA 分子要小得多。由于 RNA 的功能是多样性的，RNA 的种类、大小和结构都较DNA 多样化。DNA 与 RNA 性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。一、材料与方法的选择（一）材料与方法的选择临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等；核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、纯度和浓度可能有不同的要求；至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑；在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。近年来，有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用，能批量制备核酸样品，大大提高了分离与纯化的效率。（二）选择的原则核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量、待分2离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。（三）核酸完整性的保持为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制 pH 在 4～10 之间，就可以很好地避免其危害；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在 0～4℃的条件下进行。其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏； DNA 酶（DNase 或 DNAase）的激活需要Mg2+、Ca 2+等二价金属离子，若使用 EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制 DNA 酶的活性。RNA 酶（RNase 或 RNAase）的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是 RNA 提取过程中的主要危害因素。二、技术路线的设计（一）核酸的释放正常情况下，无论是 DNA 还是 RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法两大类。机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性 DNA 分子，因此该类方法不适合于染色体 DNA的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。（二）核酸的分离与纯化细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结3合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下，要从中分离出一定量的、符合纯度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上，利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异、物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。应该去除的污染物主要包括三个部分：即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。非核酸大分子污染物主要包括蛋白质、多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA 时，RNA 为污染物，制备 RNA 时，DNA 为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。（三）核酸质量与提取步骤的关系一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用 70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。 三、鉴定、保存与应用4（一）核酸的鉴定1．浓度鉴定 核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在 250nm～270nm 之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为 260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长 260nm 的紫外线下，1 个 OD 值的光密度大约相当于 50µg/ml 的双链DNA， 38µg/ml 的单链 DNA 或单链 RNA，33µg/ml 的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若 DNA 样品中含有盐，则会使A260 的读数偏高，尚需测定 A310 以扣除背景，并以 A260 与 A310 的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于 0.25µg/ml 的核酸溶液。（2）荧光光度法：荧光光度法以核酸的荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB ）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达 1ng～5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold 作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于 20pg 的双链 DNA。2．纯度鉴定 紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法主要通过 A260 与 A280 的比值来判定有无蛋白质的污染。在 TE 缓冲液中，纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，纯RNA 的 A260/A280 比值为 2.0。比值升高与降低均表示不纯。其中蛋白质与在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白质的紫外吸收峰在 280nm 与酚在 270nm的高吸收峰可以鉴别主要是蛋白质的污染还是酚的污染。RNA 的污染可致DNA 制品的比值高于 1.8，故比值为 1.8 的 DNA 溶液不一定为纯的 DNA 溶液，可能兼有蛋白质、酚与 RNA 的污染，需结合其它方法加以鉴定。A 260/A280 的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标，2.0 是高质量 RNA 的标志。但要注意，由于受 RNA 二级结构不同的影响，其读数可能会有一些波动，一般在51.8～2.1 之间都是可以接受的。另外，鉴定 RNA 纯度所用溶液的 pH 值会影响A260/A280 的读数。如 RNA 在水溶液中的 A260/A280 比值就比其在 Tris 缓冲液（pH 7.5）中的读数低 0.2～0.3。（2）荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于 DNA 分子较 RNA 大许多，电泳迁移率低；而 RNA 中以rRNA 最多，占到 80%～85%，tRNA 及核内小分子 RNA 占15%～ 20%， mRNA 占 1%～5%。故总 RNA 电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的 23S、16S 的 rRNA 条带及由 5S 的 rRNA 与 tRNA 组成的相对有些扩散的快迁移条带。在真核生物为 28S、18S 的 rRNA 及由5S、5.8S 的 rRNA 和 tRNA 构成的条带（图 6-1） 。 mRNA 因量少且分子大小不一，一般是看不见的。通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，我们可以鉴定 DNA 制品中有无 RNA 的干扰，亦可鉴定在 RNA 制品中有无DNA 的污染。3．完整性鉴定 常规使用凝胶电泳法。（1）凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。基因组 DNA 的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子 DNA 片段，在电泳图上可以显著地表现出来。而完整的无降解或降解很少的总 RNA 电泳图，除具特征性的三条带外，三条带的荧光强度积分应为一特定的比值。沉降系数大的核酸条带，分子量大，电泳迁移率低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。一般 28S（或23S）RNA 的荧光强度约为 18S（或 16S）RNA 的 2 倍，否则提示有 RNA 的降解。如果在加样槽附近有着色条带，则说明有 DNA 的污染。（2）其它方法：必要时，还可以通过一些特殊的试验来分析 RNA 的完整性，如小规模的第一链 cDNA 合成反应、以放射性标记的寡脱氧胸苷酸oligo(dT)为探针的 Northern 杂交以及对已知大小的 mRNA 的 Northern 杂交。另外，随着毛细管电泳与生物芯片技术的飞速发展，有关核酸的分离、纯化、鉴定与回收的手段日益丰富。（二）核酸的保存核酸的结构与性质相对稳定，无需每次制备新鲜的核酸样品，且一次性制6备的核酸样品往往可以满足多次实验研究的需要，因此有必要探讨核酸的贮存环境与条件。与分离纯化一样，DNA 与 RNA 的保存条件也因性质不同而相异。1．DNA 的保存 对于 DNA 来讲，溶于 TE 缓冲液在-70℃可以储存数年。其中 TE 的 pH 值为 8，可以减少 DNA 的脱氨反应而 pH 低于 7.0 时 DNA 容易变性；EDTA 作为二价金属离子的螯合剂，通过螯合 Mg2+、Ca 2+等二价金属离子以抑制 DNA 酶的活性；低温条件则有利于减少 DNA 分子的各种反应；双链DNA 因结构上的特点而具有很大的惰性，常规 4℃ 亦可保存较长时间；在 DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。2．RNA 的保存 RNA 可溶于 0.3mol/L 的醋酸钠溶液或双蒸消毒水中，-7