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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询腺病毒介导 EGFP 基因转染神经干细胞的实验研究【摘要】 目的 探讨腺病毒（adenovirus）介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在神经干细胞（NSCS）的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法 用不同感染复数的携带 EGFP 基因的腺病毒（Ad/ EGFP）转染 NSCS，在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP 的表达情况，同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果 Ad/EGFP 转染 16 h 后 NSCS 发出绿色荧光，在第 7 天左右荧光强度达高峰并可持续稳定
2、表达 20 天左右，Nestin 表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光，部分细胞 - tubulin、GFAP 表达阳性。同时观察到对照组和转染组的 NSCS 在第7 天、14 天、21 天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异（P 0.05） 。结论 Ad/EGFP 可以高效转染新生大鼠海马 NSCS，且不影响 NSCS 的存活、生长和分化。 EGFP 基因是神经干细胞的理想的报告基因。 【关键词】 神经干细胞 腺病毒 增强型绿色荧光蛋白 转染 基因表达 Abstract: Objective To observe the expression of enhanced gree
3、n fluorescent protein （EGFP） in neural stem cells （NSCS ） with adenovirus vector-mediated enhanced GFP gene （Ad/EGFP） and the changes in the biological characters of NSCS in relation to the transfection. Methods 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询NSCS from the hippocampus of neonate rat were isolated, cultur
4、ed, passaged and identified. The NSCS were transfected with varied doses of EGFP-adenovirus vector to observe the EGFP expression under phase contrast microscope and fluorescentmicroscope. The vitality, multiplication and differentiation of the cells were examined by using trypan blue staining etc.,
5、 and the results were compared between the transfected and the control groups. Results The emission of green fluorescence in neurospheres started 16 hours after the transfection, intensified gradually, reached its peak on day 7 and maintained that high level for more than 20 days. The green fluoresc
6、ence was also present in the cell body and fine dendrites of the neurons and glial cells in the transfected group. No significant differences were found in cell vitality, multiplication and differentiation between the transfectd and control groups on days 7, 14 and 21. Conclusion Ad/EGFP can efficie
7、ntly transduce NSCS without causing changes in their biological characteristics, and therefore is an ideal method for genetic labeling of NSCS. Key words: neural stem cells; adenovirus vector; enhanced green fluorescent protein; transfection; gene 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询expression 神经干细胞（NSCS）是指一类
8、具有多分化潜能（能分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞） ，能自我更新和克隆性增殖的一群细胞1 。在 NSCS 移植研究中，有必要对 NSCS 进行示踪标记，以便实时跟踪和区分植入的 NSCS 和宿主细胞。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新的报告基因，其表达产物 GFP 可在紫外光或蓝色光激发下稳定地发出绿色荧光，不需要任何底物或辅助因子。在 GFP 的基础上进行 F64L 和 S65T 突变后的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）进一步增强了 GFP 的荧光性能，使结果更容易观察检测2 。本实验从新生 SD 大鼠海马组织中分离神经干细胞，并
9、通过观察携带 EGFP 基因的腺病毒（Ad/ EGFP）转染NSCS 后 EGFP 表达规律及转染对 NSCS 的活力、增殖、分化等的影响，探讨 EGFP 作为 NSCS 的示踪标志物的可行性，为进一步的 NSCS 移植研究提供体外研究基础。 1 材料和方法 1.1 动物 24 h 之内的新生 SD 大鼠，由徐州医学院实验动物中心提供。 1.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12、B27、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子） 、EGF（表皮生长因子）均购自 Gibco 公司 。抗体为:Nestin 兔抗鼠多克隆抗体（博士德公司） ，GFAP 单克隆抗体（Sigma公司） ，- tubulin 单克
10、隆抗体（Sigma 公司） ，生物素标记山羊抗小鼠 IgG（北京中杉生物试剂公司） ，山羊抗兔 Cy3-IgG（博士精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询德公司） ，DAB（北京中杉生物试剂公司） ，胎牛血清（FBS，杭州四季青生物试剂公司） 。仪器：CO2 培养箱（Thermo，美国） ，荧光倒置相差显微镜（Olympus IX70，日本） 。病毒载体：Ad/EGFP，滴度为 21011pfu/L。 1.3 方法 1.3.1 NSCS 的分离、培养及鉴定 取新生大鼠置于 0.5%碘伏中消毒，取脑，分离海马，剥离脑膜血管，将海马组织移入含有 2%B27的高糖 DMEM/F12 培
11、养液中，尽量将组织剪碎，轻轻吹打制成细胞悬液，400 目筛网过滤，台盼蓝染色，细胞计数，以 2106 个/L 接种到 6 孔培养板内，最后加入 EGF（终浓度 20 g/L）和 bFGF（终浓度 20 g/L） ，置 37、5%CO2 平衡湿度培养箱中。每 23 天半量换液 1 次，每 710 天传代 1 次。对第 3 代培养 7 天的细胞球参照文献3用 Nestin 免疫荧光染色法进行鉴定，荧光倒置相差显微镜观察拍照。 1.3.2 Ad/EGFP 转染 NSCS 把第 3 代培养 7 天的细胞按 2105 个/孔接种到 24 孔板，每孔加入 DMEM/F12+EGF+bFGF 培养液 1 m
12、l，转染前 1 天半量换液。实验分为 5 组，感染复数（multiplicity of infection，MOI）分别为 01（对照组） 、101、201、501、1001，每组设 8 孔。根据感染复数计算加入所需腺病毒悬液的体积数，在 EP 管中将所需的腺病毒悬液与无血清的 DMEM/F12 培养液混合，将混合液按照分组分别加入到每组细胞中，每孔 0.2 ml。将 24 孔板置于 37、5%CO2 培养箱中培养，4 h精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询后用 DMEM/F12 清洗细胞 2 次，弃病毒残液。每 8 h 观察 EGFP 的表达情况，常规半量换液。转染后 48
13、h，在 200 倍荧光显微镜下，随机选取 5 个视野，分别计算绿色荧光阳性细胞百分数，用以代表Ad/EGFP 对 NSCS 的转染效率。 1.3.3 Ad/EGFP 体外转染对神经干细胞增殖的影响 各组分别在第 7 天、第 14 天、第 21 天细胞传代时各取 100 l，用台盼蓝染色并计算细胞活力，计算公式为 ：细胞活力（%） = （细胞总数-死亡细胞数）/细胞总数100%。并在 100 倍显微镜下，各组选取培养板 4 角的 4 个区域及中央 1 个区域进行神经干细胞球的计数。参照文献3用 Nestin 荧光免疫细胞化学染色法对培养的细胞球进行鉴定。 1.3.4 Ad/EGFP 体外转染对神
14、经干细胞分化的影响 对照组和转染组的神经干细胞球在培养第 7 天时用 10%FBS 诱导分化，在第 14天行免疫细胞化学反应，具体步骤参照文献4 。每组任选 3 孔，每孔随机选择 5 个视野，相差显微镜下 400 倍视野计算细胞总数、- tubulin 和 GFAP 阳性细胞数，同时计算阳性细胞数占细胞总数的百分比；藉此区分神经元、星形胶质细胞，以鉴定转染Ad/EGFP 的 NSCS 的多分化潜能。 1.4 统计学处理 计量资料以 xs 表示，用单因素方差分析及两两比较检验；计数资料应用 2 检验。数据应用 SPSS10.0 进行统计学处理。检验水准:=0.05 。 2 结 果 精品文档欢迎来
15、主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询2.1 神经干细胞形态学特征及鉴定 原代细胞培养 8 h 后，镜下观察细胞均以单个细胞或小细胞簇形式分布在培养液中，细胞呈圆球形，折光性强，很少见细胞贴壁生长。细胞在 48 h 内聚集成细胞球并在球内分裂增殖，细胞球体积增大。经 7 天左右培养后，细胞呈球状集落，排列紧密，细胞球直径达 1 mm 左右，肉眼可见芝麻粒大小的球形物质悬浮在培养液中，镜下观察到单个细胞球含有几十至几百个细胞不等（图 1） 。经 Nestin 荧光免疫细胞化学染色鉴定，培养的细胞均呈阳性（图 2） 。 2.2 Ad/EGFP 体外转染神经干细胞 加入腺病毒混合液后，在相差显微镜下
16、观察，对照组和转染组的神经干细胞在形态上均成球形，无明显差异（图 3） 。在荧光显微镜下观察，对照组无绿色荧光发出，转染组的各组细胞在 16 h 左右就开始出现稀少的微弱绿色荧光，开始时荧光强度不一，随着时间推移荧光强度逐渐增强；在 48 h 左右，绝大部分神经干细胞球被转染，但每一个细胞球内既有被转染的细胞又有未被转染的细胞，呈现荧光强度不一、散在分布的现象。不同 MOI 值的 Ad/EGFP 对 NSCS 转染效率分别为60%、76%、90%、92%，转染百分比随 MOI 值上升而升高。而当 MOI值超过 501 时，转染效率升高不明显，所以 MOI 为5011001 时即可获得较高的转染效率，可达 90%以上。在第 7天左右，几乎全部的细胞被转染并呈现较强的绿色荧光球（图 4） 。对转染后的细胞球进行 Nestin 荧光免疫染色鉴定呈阳性（图 5） ，证明经 Ad/EGFP 转染后的细胞仍是神经干细胞。 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢
