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1、1EV71 病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定作者：李静, 蔡芳, 高强 , 王宾【摘要 】 目的: 筛选高亲和力和高中和活性的抗 EV71 病毒的单克隆抗体(mAb), 并对其特异性和抗原表位进行鉴定。方法: 采用葡萄球菌 A 蛋白亲和层析法纯化 mAb, 并进行抗体的中和效价、 交叉反应性以及表位进行分析。结果: 筛选出 1 株抗 EV71 病毒的mAb, 纯度大于 95%, 抗体滴度达到 10-7, 对 EV71 病毒具有广谱中和特性, 与 CA16 无交叉反应, 为 VP1 特异性 , 并识别 EV71 的构象型表位。结论: 筛选出 1 株具有高亲和力和中和活性的 EV71 病毒的 mA
2、b, 为研制 EV71 病毒感染性疾病的诊断试剂提供了重要工具, 并为研制治疗性 mAb 提供了条件。 【关键词】 EV71; 单克隆抗体; 中和活性肠道病毒 71 型（EV71）是人肠道病毒的一种, 其感染性强且致病率高, 对中枢神经系统的侵害尤其严重1 。EV71 与 A 组柯萨奇病毒（Cox Al6 型, CA16）是引起手足口病的主要病原体。手足口病是全球性传染病, 近年来手足口病已经成为越来越威胁国内外儿童健康的广泛流行性疾病之一。为指导全国各地做好手足口病的预防控制, 2008 年卫生部发布 手足口病预防控制指南; 规定自22008 年 5 月 2 日起, 手足口病纳入丙类传染病管
3、理。EV71 病毒为小 RNA 病毒科、 肠道病毒属。引起的手足口病预防控制难度大, 目前针对 EV71 引起疾病的疫苗、 特异性治疗药物等防控手段尚在研制中。高质量的 EV71 单克隆抗体（mAb）有可能用于研制治疗性 mAb、 EV71 患者血清学诊断以及 EV71 病毒疫苗的抗原含量的检测, 因此具有重要的应用价值。我们在本实验中筛选了多批 EV71 mAb, 并对其生物学特性进行了比对研究。1 材料和方法1.1 材料 抗 EV71 病毒 mAb 腹水由北京科兴生物制品有限公司提供, 共 12 个克隆, 编号 No.1-No.12。PEG2000 购自 Sigma 公司。Micro BC
4、ATM Protein 购自 PIERCE 公司, HRPGAM IgG 购自 Jackson ImmuNoresearch。其他试剂由北京科兴生物制品有限公司提供。Gel200 凝胶成像仪购自 Kodak 公司。1.2 方法1.2.1 mAb 的腹水效价测定 采用间接 ELISA 法2 。纯化后的EV71 病毒抗原用 0.01 mol/L PBS 1100稀释, 包被于酶标板, 4过夜; 以含 100 mL/L 小牛血清、 10 g/L 酪蛋白、 100 g/L 蔗糖(北京科兴生物制品有限公司提供) 的 0.01 mol/L PBS 溶液封闭。3mAb 腹水用 0.01 mol/L PBS
5、溶液 10 倍系列稀释后加入酶标板反应, 酶标二抗为 HRPGAM IgG, 用 TMB 显色, 读取 A450 值。BALB/c 小鼠阴性血清作为阴性对照。以阴性对照 A 值的 2.1 倍作为阈值, 来判定 mAb 腹水的效价。1.2.2 mAb 腹水的纯化 将 mAb 腹水采用葡萄球菌 A 蛋白（SPA ）亲和层析法纯化3 , 并用 PEG2000 浓缩纯化后 mAb; 采用 Micro BCATM Protein Assay Kit 检测纯化抗体蛋白浓度 ; 常规还原型 SDSPAGE分析纯度, 分离胶浓度 120 g/L, 浓缩胶浓度50 g/L, Gel200 凝胶成像仪扫描电泳胶分
6、析纯度。1.2.3 mAb 的中和效价测定 采用细胞培养法。将 mAb 腹水 10倍系列稀释, 与 A、 B、 C 3 种基因型的 EV71 病毒混和 37 2 h后, 接种于 Vero 细胞 , 培养 7 d, 观察细胞病变, 计算 mAb 腹水对EV71 3 种基因型病毒的中和效价。1.2.4 交叉反应 采用点杂交法（Dotblot 法） 。mAb 腹水用50 g/L 脱脂奶粉 11 000 稀释后, 分别与 EV71 病毒液、 Cox Al6 型病毒液进行 dotblot试验。抗原（ 2 L/点）点样于硝酸纤维膜, 风干后将膜于 50 g/L 脱脂奶粉中室温封闭 2 h, 将膜转移到稀释
7、 mAb 中室温摇动反应 2 h, 洗膜 3 遍 , 将膜转移到 12 000稀释的 APGAM中, 室温摇动反应 1.5 h; 洗膜, 碱性磷酸酶底物4显色。1.2.5 mAb 的表位分析 采用 Dotblot法。EV71 No.6 底物mAb 腹水稀释后, 分别与 EV71 病毒液、 基因重组 EV71 病毒VP1、 VP2 和 VP3 蛋白进行 Dotblot试验。阴性对照采用无关mAb 腹水。2 结果2.1 mAb 的腹水效价 经间接 ELISA 法检测, No.2、 No.3 和No.6 mAb 效价分别达 10-6、 10-5 和 10-7, No.4、 No.5、 No.10 和
8、 No.12 mAb 效价为 10-4。2.2 mAb 的纯化结果 经还原型 SDSPAGE可见, SPA 亲和层析法纯化的 mAb 在 Mr 50 000 与 28 000 处有 2 条蛋白条带, 分别为 mAb 的重链和轻链。采用 Gel200 凝胶成效仪扫描分析该 mAb纯度95（图 1） 。2.3 中和试验结果 表 1 显示了 3 株 mAb 对于 EV71 病毒的中和活性, No.2、 No.3 对 EV71 病毒无中和活性。 No.6 mAb 对 EV71病毒 A、 B 和 C 3 种基因型均有中和效果, 说明其具有广谱性; No.6 mAb 对 EV71 病毒 A、 B 和 C
9、3 种基因型的中和效价5120。52.4 交叉反应结果 采用点杂交法对 No.6 mAb 进行交叉反应, 结果表明 No.6 mAb 与 Cox A16 型病毒液无交叉反应 , 仅与 EV71病毒液反应, 说明 No.6 mAb 是针对 EV71, 特异性好。2.5 mAb 识别的表位分析 采用点杂交法对 No.6 mAb 进行表位分析。识别 No.6 mAb 仅与未变性的重组 EV71 VP1 蛋白反应, 而对于变性的基因重组 VP1 蛋白无反应, 说明该 mAb 特异性结合抗原表位位于病毒外壳蛋白的 vp1 区, 并可能是一种构象型表位（表2） 。表 1 EV71 mAb 对 EV71 病
10、毒株的中和滴度表 2 EV71 No.6 mAb 识别 EV71 VP 的表位分析3 讨论EV71 属于微小核糖核酸病毒科（Picornaradae ）肠道病毒属（Enterovirus）的成员, 分为 A、 B、 C 3 种基因型, 为单股正链RNA 病毒4 。对 EV71 病毒研究表明, EV71 病毒抗原表位主要集中于 VPl、 VP2 和 VP3 上。EV71 病毒中和抗原决定簇主要集中于 VPl 上5 。vp1 基因具有与病毒血清型完全对应遗传多样性, 以及其变异快速的特点, vp1 基因是 EV71 病毒基因分型的重要依据6, 7 。本研究中, 我们筛选了 12 株抗 EV71 m
11、Ab, 采用间接 ELISA 法6测定 mAb 的腹水效价, 细胞培养法测定 mAb 的中和效价。No.6 mAb 不仅效价高, 而且对 EV71 病毒 A、 B、 C 3 种基因型均有较高的中和效价, 说明其具有广谱性。No.6 mAb 的表位分析结果表明该 mAb 结合抗原构象表位位于病毒外壳蛋白的 VP1 区, 而且与EV71 VP2 和 VP3 以及 CA16 无交叉反应。筛选出高效价、 高中和特性、 高特异性的 EV71 mAb No.6 可为进一步研制治疗性 mAb、 制备较高特异性的诊断试剂盒以及病毒疫苗的抗原含量检测提供重要条件。【参考文献】 1 Komatsu H, Shim
12、izu Y, Takeuchi Y, et al. Outbreak of severe neurologic involvement associated with Enterovirus 71 infectionJ. Pediatr Neurol, 1999, 20(1): 17-23.2 李永清 , 杨 敬, 张 莉, 等. 抗禽流感病毒 M2 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定J. 细胞与分子免疫学杂志 , 2008, 24(5): 475-478.3 Valds Veliz R, Garcca J, Reyes B, et al. A very sensitive enzymelinked
13、immunoabsorbent assay to Staphylococcal Protein A in the presence of 7immunoglobulinsJ . Biochem Biophys Res Commun, 2003, 303(3): 863-867.4 金 奇. 医学分子病毒学M. 北京: 科学出版社, 2001: 606-613.5 周世力 , 艾晓武, 董长垣, 等. 肠道病毒 71 型 SHZH03 结构蛋白基因的遗传进化分析J. 公共卫生与预防医学, 2007, 18(1):18-20. 6 McMinn PC. An overview of the evolution of Enterovirus 71 and its clinical and public health significanceJ. FEMS Microbiology Reviews, 2002, 26(1): 91-107.
