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1、1CCL20 在胸腺 CD4+CD25+T 细胞发育过程中的作用及其意义作者：邵先安, 熊思东, 张瑞华, 袁福华, 王勇, 陈芝河, 徐长江【摘要 】 目的: 研究趋化因子 CCL20 对小鼠胸腺CD4+CD25+双阳性 T 细胞发育的影响, 为天然调节性 T 细胞调控的研究提供基础数据。方法: 采用 14.5 d 龄胚鼠胸腺进行体外培养, 以流式细胞术（FCM）检测不同时间点胸腺 CD4+CD25+细胞的变化, 同时计数每个胸腺小叶的细胞数变化。结果: 体外胸腺培养的第16 天胸腺细胞比例, 细胞数量趋势变化与胸腺体内发育的第14.5、 15、 16、 17、 18、 19 天 CD4+C
2、D25+双阳性 T 细胞的比例, 细胞数量的趋势变化相似; 在胸腺体外培养的第 16 天, CD4+CD25+T 细胞占 CD4+T 细胞的比例分别为 58.29%、 12.14%、 6.08%、 17.78%、 9.06%、 4.04%, 占 CD25+T 细胞的比例分别为 3.75%、 10.81%、 17.20%、 51.93%、 61.64%、 80.06%, 这一发育趋势与体内结果具有一致性。在 4 mg/L 的 CCL20 干预下, 胸腺体外培养的第 3、 6 天 CD4+CD25+胸腺细胞分别从 3.240.18、 3.960.24 下降至 1.270.11、 1.760.22（
3、P0.001） 。结论: 体外培养的 CD4+CD25+双阳性胸腺细胞数量和比例变化与体内发育变化趋势一致, CCL20 明显下调胸腺 CD4+CD25+的表达, 这将为天然调节性 T 细胞的调控研究2提供有效的参考依据。 【关键词】 胸腺细胞 CD4+ CD25+ CCL20 体外胸腺器官培养Sakaguchi 等1研究发现, 给小鼠输入 CD4+CD25+T 细胞, 会下调免疫应答, 研究者们进一步在动物模型和临床病例证实该细胞参与自身免疫病的发生、 肿瘤的免疫逃避以及移植物抗宿主反应。随后的研究证实了该群细胞为 CD4+CD25+foxp3+调节性 T 细胞, 小鼠体内输注经同种抗原活化
4、的 CD4+CD25+T 细胞, 可引起特异性免疫耐受2, 不仅如此, 它在免疫系统发育、 自身免疫、 肿瘤逃逸等过程中均扮演重要的角色, 成为当前免疫学研究的热点。调节性 T 细胞分为天然调节性 T 细胞和诱导调节性 T 细胞, 其中天然调节性 T 细胞对机体具有举足轻重作用。目前就其来源、 亚群、 特点、 转归及其在 T 细胞活化中的作用研究都有了长足的进展, 但对这群细胞在胸腺发育中的变化及调控因素尚不清楚。而 CCL20是 CC 亚家族的趋化因子3, 该趋化因子的受体分布于未成熟的树突状细胞、 T 细胞、 B 细胞上4-6, 在固有免疫和获得性免疫中都发挥着重要的作用7。人们对 CCL
5、20 的研究显示该趋化因子在胸腺中表达明显8, 其受体 CCR6 是调节性 T 细胞的标志之一9, 但其在胸腺中存在的意义以及其是否参与胸腺 CD4+CD25+T 细胞的发育尚不清楚, 因此本研究拟采用不同孕龄的胎鼠, 以体外胸腺器官培养（fetus thymus organ culture, FTOC）技术在体外以3CCL20 对调节性 T 细胞进行干预实验, 对 CD4+CD25+T 细胞的体内外发育状态进行比较研究, 以期为该群细胞发育和调控的深入研究提供了依据。1 材料和方法1.1 材料 8 周龄左右成熟雌性和雄性 BALB/c 小鼠(H2d), 雌鼠 120 只 , 雄鼠 20 只,
6、 由复旦大学实验动物中心提供。不同日期的孕鼠由本实验室负责交配完成。细胞培养试剂RPMI1640（Gibco BRL 公司） 、 L谷氨酰胺（政翔化学试剂研究所）; 双抗（氨苄青霉素钠、 硫酸链霉素） （上海第四制药厂）; 小牛血清/NBS（上海华美生物公司）; 胎牛血清（浙江四季清生物制品有限公司）; FITC 标记兔抗小鼠 CD4 单克隆抗体（mAb ）（Becton Dickinoson 公司）; PE 标记山羊抗小鼠 CD25 mAb（Becton Dickinoson 公司） 。显微外科镊、 剪（上海医疗器械有限公司）; 0.8 m 微孔滤膜（上海半岛实业有限公司） ; D6450H
7、anao CO2 培养箱（Heraeus 公司）; FACSCalibur 流式细胞仪（Becton Dickinoson 公司） 。趋化因子 CCL20（1 g/L, 达科为公司） 。1.2 方法41.2.1 孕鼠交配与鉴定 按照我们已建立的孕龄测定方法和体外培养系统, 取成熟雌性小鼠 23 只和雄性小鼠 1 只于前 1 d 晚900 左右合笼, 次日晨 800 左右取出雌性小鼠, 以见到阴栓形成为确认怀孕日期, 并计算为 0 d, 将其单独饲养并标记, 在 14.5 d 时再次观察腹部确认怀孕, 解剖孕鼠, 摘取胚鼠胸腺小叶用于实验10。1.2.2 胚鼠胸腺器官的培养 医用明胶海绵切成 1
8、 cm2 左右的方块, 放入 24 孔板中, 加入 1 mL RPMI1640 培养液（含 200 mL/L FBS） 。灭菌滤膜充分湿润后覆盖在明胶海绵上 , 吸弃 0.5 mL培养液, 使 24 孔板中最终剩 0.5 mL 培养液。颈椎脱位处死孕鼠, 从孕鼠子宫中取出胚鼠, 置于加有 PBS 的 100 mm 的平皿中, 根据大小等特征再次判断其胚龄。剪开胚鼠胸腔, 取出胸腺小叶经 PBS充分清洗, 每孔加 8 个胸腺小叶, 每组均为双复孔进行培养。CCL20干预组在培养的第 0、 3 天加趋化因子 CCL20（终浓度为 4 mg/L） 。体内胸腺细胞发育过程的研究分别取不同孕龄的母鼠,
9、依照以上步骤取出胸腺小叶后, 制成单细胞悬液, 计数、 染色10。1.2.3 流式细胞术检测 制备胚鼠胸腺单细胞悬液。毛玻片碾碎, PBS 洗 3 次, 弃上清 , 调整细胞数为 2.5109/L, 加入 1 L FITC标记 CD4 和 PE 标记 CD25 mAb（10 mg/L）, 轻轻混匀, 4, 避光, 静置 30 min。PBS 洗 3 次后, 用 500 L PBS 重悬, 流式细胞5术检测。检测体外培养胸腺时, 将胸腺小叶从滤膜上取出, 依照以上方法制成悬液并染色, BDcaliber 机型检测 , Cellquest 软件分析10。1.2.4 统计学处理 所得数据用 SPSS
10、11.5 软件处理。2 结果2.1 体外及体内胸腺细胞总数的变化 系统反映存在于胸腺细胞中的 CD4+CD25+双阳性细胞的体内外发育状况, 首先观察了整个胸腺细胞的数量变化。结果显示: 14.5 d 胚龄鼠的胸腺细胞为双阴性时期或者稍有阳性, 是进行胸腺细胞发育研究的最佳起始时间10。体内发育过程中, 胎鼠胸腺小叶随发育时间增加逐渐增大, 胸腺细胞总数随母鼠育龄的增加持续增多, 从第 14.5 天的 0.59104/每叶胸腺增加至第 15 天时的 0.74104/每叶胸腺 , 出生前每叶胸腺的细胞数量上升至 2.68106, 出生 24 h 内检测发现每叶胸腺的细胞数进一步增至 6.4310
11、6。与体内胸腺细胞发育规律类似, 体外培养显示: 在 6 d 时间内, 胸腺细胞表型由 CD4-CD8-双阴性向CD4+CD8+双阳性细胞发育。体外培养时肉眼可见胸腺小叶比培养起始时有形态的增大, 细胞计数显示每个胸腺小叶细胞数量随培养时间的增加而增多。培养第 1 天时每个胸腺小叶的细胞数量比刚取出时略有下降, 从第 0 天的 0.59104 下降为 0.51104, 第 2 天开6始上升, 到第 6 天时每个胸腺小叶细胞数量增长到 1.38106（图1） 。图 1 胚鼠胸腺细胞数目的体内外动态变化（略）2.2 CD4+CD25+双阳性胸腺细胞的体内外发育 进一步研究CD4+CD25+双阳性胸
12、腺细胞的体内外发育状况显示: 在体内情况下, 14.5 d 胚鼠的胸腺细胞中 CD4+CD25+占全部胸腺细胞的比例为 0.13%, 17 d 增至峰值 4.13%, 而后降低至 19 d 的 2.03%（图2A） 。CD4+CD25+细胞数在 14.5 d 为 0.025104/胸腺小叶, 17 d 增加至 3.07105/胸腺小叶, 而后增至 19 d 的 5.41104/胸腺小叶（图 2B） 。CD4+CD25+ 占 CD4+细胞的比例在 14.5 d 为 9.19%, 16 d 增至峰值 24.05%, 而后持续降低至 19 d 的 2.35%（图 2C） 。CD4+CD25+占 CD
13、25+细胞的在 14.5 d 比例为 0.35%, 后随发育时间的增加而持续增至 34.04%（图 2D） 。体外培养的胸腺细胞与体内胸腺细胞发育规律类似: 体外培养 1 d 时, 胸腺细胞中CD4+CD25+的比例体内为 1.87%, 4 d 增至峰值 10.85%, 而后降低至 6 d 的 3.54%（图 2A） 。CD4+CD25+细胞数在 1 d 为0.01104, 4 d 增加至 4.31104, 持续增至 6 d 的 4.89104（图2B） 。CD4+CD25+占 CD25+细胞的在 1 d 比例为 3.75%, 持续增加至 80.06%（图 2D） 。仅 CD4+CD25+占
14、CD4+细胞的比例与体内不同, 在 1 d 为 58.29%, 而后持续降低至 6 d 的 4.04%（图 2C） 。7图 2 胚鼠胸腺细胞中 CD4+CD25+细胞的体内外动态变化（略）A: CD4+CD25+胸腺细胞百分比; B: CD4+CD25+胸腺细胞数; C: CD4+CD25+/CD4+百分比; D: CD4+CD25+/CD25+百分比.2.3 CCL20 干预胸腺 CD4+CD25+细胞的发育 由于 CCL20表达于胸腺中, 为了研究 CCL20 是否对胸腺 CD4+CD25+细胞的发育产生影响, 以一定浓度的 CCL20 与胸腺细胞共培养 , 结果显示在不同培养时间点均有不
15、同程度的影响（表 1）, 在培养的第 3、 6天, CD4+CD25+胸腺细胞的比例明显降低, 进一步的实验表明CCL20 浓度的增加, CD4+CD25+胸腺细胞在体外培养时其所占胸腺细胞的比例呈剂量依赖关系（图 3）, 提示 CCL20 在胸腺CD4+CD25+细胞的发育过程中扮演着重要作用。图 3 CCL20 抑制胸腺细胞的发育呈剂量依赖性（略）表 1 CCL20（4 mg/L）干预胸腺 CD4+CD25+细胞的发育（略）83 讨论国内有文献显示胎儿胸腺细胞悬液可抑制混合淋巴细胞反应, 提示胸腺中存在具有抑制功能的一群细胞。由于其具有的独特作用方式和功能特征, 天然产生的 CD4+CD2
16、5+Treg 细胞受到广泛关注, 该细胞表面表达非专一的CD25/CD62L/CD103/CTLA4/GIT/FoxP3 等分子标记11。外源性分子对胸腺细胞的数量和表型可能产生一定程度的影响12, 胸腺髓质树突状细胞对 CD4+CD25+Treg 细胞的发育分化有作用, 共刺激分子和细胞因子也参与了胸腺 CD4+CD25+Treg 的产生13, 为了研究趋化因子 CCL20 是否对胸腺细胞中的CD4+CD25+双阳性细胞的发育有调控作用, 首先观察了总的胸腺细胞的数量情况和 CD4+CD25+双阳性胸腺细胞体内外发育状况, 该群细胞在体内外的数量和比例变化表现具有一致性。在上述试验的基础上, 进一步比较了 CD4+CD25+双阳性 T细胞的体内外发育状况。随着胚鼠在母鼠体内的发育, 胸腺细胞中CD4+CD25+的比例逐渐增加, 到
