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1、1D半乳糖诱导衰老动物模型研究进展作者：许扬 吴涛 顾佳黎 傅正伟【关键词】 D半乳糖；衰老模型；氧化应激；线粒体；高级糖基化终产物在上世纪 60 年代发现半乳糖会对鸡脑中能量和磷脂代谢产生有害影响1 。1985 年，中国学者徐黻本首次提出给予啮齿动物 D半乳糖（Dgal ）可以诱导类似于加速衰老进程的生理变化2 。近年来，随着该模型被大量深入研究，其致衰老的作用机制也渐为明了，这为这一动物模型的广泛应用奠定了坚实的理论基础。研究发现，经过长期 Dgal 诱导而导致的模型动物寿命缩短主要是由于氧化应激所致，引起线粒体、神经损伤，进一步表现为认知能力下降。另外，该模型具有衰老相关的高级糖基化终产
2、物（AGE ） ，并且出现免疫力下降等一系列类似自然衰老的变化。本文简要地综述了gal 半乳糖诱导衰老动物模型的研究进展及其可能的应用领域。1 半乳糖的主要代谢途径半乳糖是动物体内的正常代谢产物。哺乳动物从乳糖中获得半乳糖，乳糖在体内水解生成葡萄糖和半乳糖，而半乳糖则在肝脏中迅2速被酶解成葡萄糖。半乳糖代谢异常会引起动物生理功能显著变化。半乳糖血症是一种染色体隐性遗传的糖类代谢异常疾病。体内半乳糖及其代谢物浓度异常升高所致代谢障碍使患者的肝脏、肾脏、脑组织和晶状体成为主要受累器官，可引发白内障、肝肿大、肝硬化等并发症。鉴于半乳糖代谢的特点，研究者通过大剂量 Dgal 的给予而造成动物糖代谢紊乱
3、，成功地建立了具有特殊研究目的的动物模型。2 Dgal 诱导衰老动物模型的研究2.1 寿命缩短 根据 Hayflick 极限，成纤维细胞在体外可传代的次数与物种的寿命有关，其分裂能力与个体的年龄有关。崔旭等3观察到 Dgal 使大鼠胎脑神经元出现生长发育缓慢、突起脱落、死亡率增高等退行性变；大鼠肺成纤维细胞的体外分裂代数减少；人胎儿肺二倍体成纤维细胞分裂周期中 G2M 期细胞减少、GG1 期细胞增加，细胞增殖速度减慢，由此可见 Dgal 抑制细胞生长发育和减少分裂次数，加速细胞衰老。有研究4通过FlowFish 法证实了 Dgal 能缩短乳鼠心脏成纤维细胞端粒的长度，进一步在细胞水平明确了 D
4、gal 加速衰老的作用。Cui 等5检测了 Dgal 对于果蝇和家蝇寿命的影响。在家蝇饮水中加入 20 mg/ml 的 Dgal，发现其平均寿命雌雄分别减少319.8%和 27.1%，最大寿命雌雄分别减少 21.9%和 27.1%。同样，在果蝇的培养基添加 6.5%的 Dgal 也导致果蝇的平均寿命雌雄分别减少 15.9和 12.6，最大寿命雌雄分别减少 17.1%和12.9%。由此可见，Dgal 显著地导致了果蝇和家蝇平均寿命以及最大寿命的缩短。2.2 氧化应激 自由基的氧化积累会损伤细胞内 DNA、蛋白质、细胞膜脂质等大分子，致使机体逐渐衰老6 。个体的代谢率越高，自由基的氧化积累越快，由
5、此造成的细胞损伤也越大，其寿命也就越短7 。在 Dgal 诱导衰老模型中，过量的 Dgal 的给予导致了机体代谢率的提高，由此产生了由于自由基的增加而引起的一系列与氧化应激相关的病理生理学变化。如研究8发现 Dgal 处理导致家蝇和果蝇脑组织中丙二醛（MDA）和脂褐质(LF)显著增加，而超氧化物歧化酶（SOD）显著减少。研究9同样发现，Dgal暴露能引起啮齿类动物氧化应激损伤，如使小鼠血清和脑组织中MDA 浓度增加，总抗氧化能力（ TAOC） 、TSOD 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx ） 、谷胱甘肽（GSH）活性降低。另外，这种氧化应激损伤与诱导的 Dgal 浓度有密切的关联，并具有器官选
6、择性10 。在 1或 5浓度的 Dgal 诱导下，小鼠血液和脑组织中的 MDA 增多，而 SOD 活性下降；但是在肝脏中，只有 Dgal 注射浓度达到 5的时候，才检测到 MDA 增加，并且在两个浓度下肝脏中 SOD 相对于对照组均无变化。皮肤的氧化损伤也是衰老的重4要标志之一。衰老的胶原交联学说认为随着衰老胶原交联增加，会导致胶原敏感性降低，胶原的分解减少，弹性和韧性降低。皮肤中羟脯氨酸密度是胶原密度的间接标志。在 Dgal 模型小鼠皮肤中发现羟脯氨酸增加以及皮肤 SOD 活性下降11 。综上所述，Dgal导致模型动物强烈的氧化应激反应，进一步引起氧化损伤而加速衰老的进程。2.3 线粒体损伤
7、 目前线粒体损伤学说已作为衰老学说的一个重点部分。由于线粒体 DNA (mtDNA)缺乏组蛋白，复制快速且无校读功能以及缺乏有效的 DNA 修复机制，所以 mtDNDA 易受到自由基攻击，较易产生氧化损伤而引起突变，其突变率是核 DNA 的 10倍。mtDNA 损伤可导致线粒体功能缺陷，引起细胞衰老与死亡。研究发现在 Dgal 注射结合卵巢切除诱导的老年痴呆(AD)模型大鼠海马 CA1 区线粒体肿胀，扭曲，脊断裂12 。自然衰老大鼠会发生与人类 mtDNA 4 977 缺失类似的 mtDNA 4 834 缺失，而人类mtDNA 4 977 缺失导致老年性耳聋。研究发现 Dgal 诱导加速内耳衰
8、老13，14 ，导致大鼠不同组织以及血液样本中发生mtDNA 4 834 bp 缺失的突变率很高。自然衰老小鼠线粒体外膜上的外周型苯二氮卓受体(PBR)与其阻滞剂3HPK11195 结合会减少，二者结合活力下降反映线粒体功能受损15 ，而长期注射Dgal 导致 SD 大鼠海马突触中 PBR 与3HPK11195 特异结合减少，且无性别差异16 。52.4 神经损伤 氧化应激造成的神经毒性也是导致衰老的一个因素17 。Dgal 诱导 AD 模型大鼠12海马有 淀粉状蛋白免疫反应物，胆碱能神经元丢失。AD 生物标志物神经纤维纠缠，星形神经胶质细胞纤维紧密聚集成束，突触退化，出现髓样体。此外Dgal
9、 模型鼠海马中微管相关蛋白（Tau2 ）磷酸化增加，神经生长因子（NT3 ）减少9 。NeuN/BrdU 双重着色发现 Dgal 的诱导并不仅仅是减少粒细胞下层(SGZ)中的神经元前体的增殖，并且减少粒细胞层(GCL)新神经元的迁移和存活。因此，研究者推测长期注射 Dgal 会导致神经损伤，加速衰老，其原因可能是增强caspase 介导的细胞凋亡，抑制了神经发生和迁移，同时增加了氧化损伤8 。除了上述提及的 Dgal 模型动物海马区线粒体等损伤以外，造成 Dgal 模型动物神经损伤的原因还可能是氧化压力伴随着胞质Ca2+的平衡失调18 。Ca2+通过 L型钙离子通道大量流入，造成神经损伤，进一
10、步造成 AD 和加速衰老进程19 。使用荧光染料fura2AM 检测到 Dgal 衰老小鼠海马和大脑皮层突触内的自由Ca2+水平升高20 ；用原位杂交检测发现其生长关联蛋白(GAP43)mRNA 表达降低。而 GAP43 是调节神经突生长和再生的因子，其表达水平可以作为评价神经传入阻滞等衰老相关的指标21 。62.5 认知能力 Dgal 引起认知能力的变化是一系列反应的最终体现。长期注射 Dgal 引起氧化应激，进而导致线粒体损伤，神经退性变形，然后会引起动物认知能力下降。近年来学者用 Morris 水迷宫(MWM)、目标识别测试（ORT） 、运动行为测试（LAT） 、旷场行为、自发性运动、穿
11、越测试、Y 迷宫和强迫逃避等行为测验检测了 Dgal 诱导衰老模型动物的学习、认知、活动能力，发现 Dgal处理的动物各项表现明显变差。如在 MWM 测验时，研究发现Dgal 注射导致其空间记忆障碍，逃避反应时间和游泳的途径都比对照组长8，20 ，雌雄鼠均出现了显著的空间记忆障碍16 。另外，Dgal 诱导的认知能力下降与其使用的剂量有一定的相关性。Wei11等探讨了诱导小鼠衰老模型时 Dgal 使用的不同剂量，他们分别使用 50、100、200 mg/kg 体重的剂量每天给小鼠皮下注射用药。MWM 和 ORT 监测发现在 50 100 mg/kg 体重范围时其学习和记忆功能障碍程度与使用剂量
12、成正比，而当剂量100 mg/kg 体重时上述相关性就不再存在。2.6 其他 Dgal 诱导衰老模型动物体内检测到了 AGE。Dgal是一个还原糖，易与蛋白质或多肽的游离氨基反应生成 AGE，这个过程也叫做 Maillard 反应22 。AGE 在衰老进程中不断积累和许多老年性疾病的发病机制相关联，比如糖尿病，动脉硬化，肾病和AD。当蛋白质被 AGE 修饰，会导致大量自由基产生。AGE 会增加7氧化应激，增加异常的磷酸化作用，影响学习记忆功能。用定量ELISA 发现 Dgal 模型小鼠血清中 AGE 含量是对照组的 2.5 倍，因此，Dgal 注射使得小鼠血清中 AGE 水平升高，可加速老化，
13、提示 AGE 与 Dgal 诱导加速衰老相关联23 。无论是人类或者动物，衰老都与免疫能力的下降相关。而在 Dgal 模型小鼠脾脏中发现淋巴细胞增殖（有丝分裂发生）减少，白细胞介素2 （IL2 ）产生减少23，24 。这进一步提示 Dgal 诱导衰老模型类似于自然衰老。3 Dgal 诱导衰老的机制假设通过对以上研究的综合分析，提出以下 Dgal 诱导衰老的假设机制：首先，Dgal 代谢主要在肝脏组织，在体内醛糖还原酶作用下，生成醛糖醇和 H2O2，半乳糖醛醇不能进一步被代谢，积累过量使细胞渗透压升高，脆性增加，细胞损伤，而 H2O2 的大量生成导致胞内氧化应激增加；半乳糖代谢相关氨基酸糖 D氨
14、基半乳糖胺，也主要在肝脏代谢，过量存在也会导致尿嘧啶核苷耗竭及肝脏转录功能障碍；如果代谢中间物半乳糖1 磷酸过量积累会使肝脏中无机磷酸盐储存耗竭，也导致肝损伤。其次，研究发现 Dgal 如果大量存在，会直接进入晶状体产生沉积并诱发白内障。再次，由于 Maillard 反应的存在，Dgal 会使大量脂类和蛋白质糖基化，产生 AGE，进而导致氧自由基增加，机体氧化压力增高，最终引起细8胞老化。最后，也有学者认为 Dgal 通过羰 氨反应，形成交联产物，通过羰基毒化机制使动物体内蛋白质功能丧失，进而引起一系列的衰老改变。目前，对于 Dgal 诱导衰老模型的研究发现，随着各途径导致的氧自由基增多，机体
15、蛋白质，脂质和 DNA 的氧化损伤加重，其中特别是 mtDNA 突变而导致线粒体损伤，进而加速衰老进程，是目前衰老学说的一个热点。4 Dgal 衰老模型动物的应用Dgal 诱导衰老动物模型，在生理、生化指标各个方面类似于自然衰老，因此该模型目前广泛应用于筛选药物以及评价具有延缓衰老功能的保健食品。在药物筛选方面，经典藏药凹舌兰提取物9能明显改善Dgal 致衰老小鼠认知障碍，脑组织氧化损伤，海马神经损伤状况。中草药根提取物川牛膝多糖23 （ABP）和枸杞多糖能抑制Dgal 导致的衰老小鼠血清和皮肤非酶糖基化，而且川牛膝多糖比枸杞多糖具有更强的抗衰老作用。新鲜地黄根部的提取物梓醇25是一种环烯醚萜糖苷，它能提高 Dgal 诱导的小鼠在MWM 的学习记忆能力，增加大脑皮层和海马抗氧化酶活性，抑制自由基再生。9在具有延缓衰老功能的保健食品的评价方面，抗氧化剂和神经保护剂 硫辛酸8 (Lipoic Acid) 的保护作用可以减少 Dgal致衰老小鼠氧化应激损伤情况。每天服用 5 或 10 mg/kg 类黄酮物质槲皮黄酮20可以使脑组织中 MDA 降低和 SOD 增加，保护Dgal 导致的小鼠神经毒性损伤，削弱自发性行为空间记忆损伤26 。三萜类物质乌索酸27能减弱 Dgal 导致的神经毒性，明显减缓 Dgal 小鼠的学习和记忆损伤，提高抗氧化酶的活性，抑制 D
