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1、1VEGRR1 阳性的骨髓造血祖细胞形成转移前壁龛（微生态）摘要：肿瘤细胞向某一确定的目标位置转移的细胞及分子机制很不清楚。本课题证明，在肿瘤细胞转移之前，骨髓来源的、表达 VEGFR1（血管内皮生长因子受体 1，亦被称为 Flt1）的造血祖细胞已经来到肿瘤特定的转移前位置，并形成细胞集群。通过抗体或者将 VEGFR1+细胞从野生小鼠骨髓中去除而抑制VEFR1 功能，可以防止转移前细胞集群的形成及肿瘤的转移；反之，在Id3（分化抑制剂 3）敲除的小鼠体内重建具有 Id3 功能的 VEGFR+细胞，可以建立细胞集群并形成肿瘤转移。我们也发现，VEDFR+细胞表达 VLA-4（一种整合蛋白 a4b
2、1） ，而转移处的纤维母细胞中则有 VLA-4 的配基- 一种上调肿瘤特异生长因子的纤连蛋白；它们共同提供了允许肿瘤细胞到来的环境。该环境根据具有独特转移传播模式的不同肿瘤类型而重新调整纤连蛋白的表达以及细胞集群的形成，从而改变转移的表现。这些发现证明，VEGFR1+造血祖细胞对转移调节过程是必不可少的；同时提示，纤连蛋白及 VEGFR1+、VLA-4+集群的类型决定肿瘤扩散的器官特异性。骨髓来源细胞（BMDCs）对恶性变、肿瘤血管生成以及瘤性细胞迁移均有促进作用。之前我们在骨髓特定的某种壁龛中鉴定出表达VEGFR1的造血祖细胞（HPCs） 。在血管生成过程中，这些细胞增殖并与表达VEGFR2
3、（也称Flk1）的骨髓来源上皮细胞祖细胞一起移动至血流中，对原位肿瘤的血管生成及生长有促进作用。这些骨髓单核的VEGFR1+的细胞定位于血管周围的位置，从而增强稳定肿瘤血管。这些细胞及其他肿瘤相关细胞增强了原发肿瘤的血管生成及生长，但它们对于转移的促进作用很不清楚。该研究即着眼于明确VEGFR1+de HPCs在转移形成过程的即时功能。BMDCs在肿瘤细胞之前克隆形成转移前位点原位肿瘤皮下接种至小鼠体内以后，观察分析-乳糖阳性（-gal+）和绿色荧光蛋白阳性（GFP+）的BMDCs的变化。实验动物被接种或者 1、Lewis肺癌细胞，其一般转移至肺，偶尔转移至肝脏；或者2、B16恶性黑色素瘤细胞
4、，它具有更广泛转移的能力。辐照后，肿瘤种植前，肺内仅发现少量-gal+ BMDCs（0.01%+0.01）或者GFP+ BMDCs。接种肿瘤后14天，肿瘤细胞还没有到达局部，则已在终末支气管和远端肺泡发现-gal+ BMDCs（3.2%+ 1.2 2P0.05 by students t-test）或者GFP+ BMDCs的渗出和集群形成，这两个部位都是未来转移常见的部位。第16天，已经形成的-gal+ 细胞集群描绘出了未来转移灶的轮廓。第18天，DsRed标记的人肿瘤细胞在已存在的 BMDCs细胞集群中被发现，23天时，它们就形成了微转移灶。-gal+ BMDCs则在已形成的肿瘤转移灶中持续
5、存在。为进一步明确肿瘤细胞到达的时间， ，对肺组织进行流式细胞分析。第8天之前，仅少量GFP+ BMDCs被发现，而从第12天，开始逐渐迁移至肺，之后持续升高；第18天发现DsRed标记的肿瘤细胞。16天之前无论使用流式还是显微镜均未发现肿瘤细胞；以后随时间延长，肿瘤细胞才逐渐增多。也许极少量肿瘤细胞用以上两种方法均检测不出来，但进一步实验中我们运用了一种称为“B16恶黑调节媒介（MCM ） ”的模型，证明这种媒介独自动员了具有形成转移前壁龛能力的BMDCs。我们将DsRed标记的肿瘤细胞经静脉注入小鼠体内。试验组为B16刺激过的肺内有GFP+ BMDCs集群的小鼠，对照则未刺激过。实验组注射
6、后1天，肺内肿瘤细胞数量就升高了（141.3+10.3 versus 2.7+0.6） 。4天后， ，肺内肿瘤的大小及多少在两组中均有增加（207+5.6 versus 14+1.7） ；而与 GFP+ BMDCs集群共存的Ds-Red标记的肿瘤细胞在两个时间组均大于93% ，说明 BMDCs协助肿瘤细胞粘附增殖，因此认为，原发肿瘤的某些因素诱导BMDCs进入血流并移动至器官特异的转移前位置，而且是先于肿瘤细胞到达。BMDCs集群形成的特异性位点由肿瘤类型决定我们验证了肿瘤类型是否决定BMDCs在转移前位点的分布。皮下注射Lewis肺癌细胞最终形成的BMDCs居群局限于肺脏（47.5+2.6）
7、和肝脏（10.8+ 1.1） 。而不在于其他器官中。相比之下，B16恶黑细胞形成的BMDCs则存在于较多器官，比如肺脏（103.8+6.9） ，肝脏（41.8+ 2.4） ，胸腺（36.6+ 3.1） ，脾脏（25+3.2） ，肾脏（20.6+1.8 ） 。这些都是恶黑常见的转移器官。同时，与这两种肿瘤本身的恶性侵袭程度相符合，恶黑比Lewis肺癌细胞形成更多的BMDCs集群。募集的BMDCs中包含造血祖细胞我们鉴定了混合的BMDCs的组分。本人已肿瘤类型诱导的集群均表达EGFR1；GFP+的BMDCs集群也表达EGFR1 ，而经过辐照的肺组织几乎不表达。3进一步鉴定发现，VEGFR1+的BM
8、DCs 的子集表达干 祖细胞抗原：CD133、CD34、CD117 （ c-kit） ，提示这些BMDCs可能由表型为VEGFR1+的HPCs和先去细胞组成。原发肿瘤接种后，CD117+的祖细胞先于GFP标记的肿瘤细胞到达肺部（流式技术） ，形成募集的BMDCs的主要成分。在表达CD11b的特定的混合细胞中，存在成熟度不同而致的异质性。早期VEGFR1+的骨髓集群缺乏VEGFR2和CD31 （ PECAM1）的表达。VEGFR2+的循环内皮祖细胞与肿瘤细胞同步迁徙，进入已形成的BMDCs集群。因此我们认为骨髓来源的VEGFR1+HPCs形成并维持转移前壁龛。BMDCs集群也发生于自发肿瘤的模型
9、中该实验中我们应用导入了致癌基因c-Myc的转基因鼠。在40天时，淋巴瘤还没有发生，淋巴结中能检测出来主要的VEGFR1+集群；野生的同窝仔对照中则没有发现该集群。第120天，VEGFR1+集群持续存在于淋巴瘤之中，而围绕于VEGFR1+HPCs周围的淋巴瘤细胞并不表达VEGFR1。人体内BMDCs集群也被募集于转移前组织为了证实以上肿瘤特异的VEGFR1+细胞集群的形成在人体内具有适用性，我们分析了患恶性肿瘤的人体组织。在原发肿瘤及转移灶中，均发现了VEGFR1+的细胞集群。在没有转移的常见转移组织内发现较多的细胞集群，说明该组织具有未来转移的潜在可能性。在未患恶性疾病的病人中，淋巴结核肺组
10、织中没有发现VEGFR1+ 集群。VEGFR1+集群表达造血祖细胞标记c-kit （CD117 ）.VEGFR1+的BMDCs在引导转移中的角色、功能我们选择性地将HPCs移植至辐照后的小鼠体内，以评价提纯的VEGFR1+骨髓细胞形成转移前集群的能力。Lewis肺癌接种后24天，对照组的具有野生型骨髓的小鼠表现出显著的肺转移及其已建立的血管；而接受提纯的VEGFR1+移植的小鼠肺内形成广泛分布的无数的微转移灶及畸形的血管。相比之下，祛除骨髓中的VEGFR1+ 细胞以后，则不能形成转移前集群。这些结果表明VEGFR1+的HPCs形成了转移前集群，并能吸引肿瘤细胞到达局部。为了明确阻断VEGFR+
11、 的细胞集群的形成是否可以阻断已形成的肿瘤的转移，我们用VEGFR1和/ 或VEGFR2单抗治疗LLC 或者B16肿瘤细胞接种的小鼠。由于肿瘤细胞中没有VEGFR的表达，因此，这种方案可以选择性地作用于4BMDCs。24天时，未接受治疗的小鼠肺内出现明显的LLC肿瘤转移，或者脾内发现明显B16转移。抗VEGFR1抗体治疗清除了正在形成的集群，并完全阻止了转移。抗VEGFR2抗体没有阻止VEGFR+ 集群的形成，但是控制了转移的进程。两种抗体同时应用，效果与抗VEGFR1抗体治疗效果类似，阻断了其集群的形成。不过我们也确实在一个动物肺内观察到孤立的LLC病灶。总之，这些结果提示以VEGFR1+
12、为目标的治疗可以防止肿瘤细胞粘附、增殖及转移性扩散。VLA-4（也称整合蛋白 intergrin 41） 、MMP9 （基质金属蛋白酶9）及Id3（inhibitor of differentiation 3）介导了转移前壁龛形成我们研究了迁移的HPCs与微环境相互作用而形成允许转移的转移前壁龛的分子及细胞机制。VLA-4 与其配基纤连蛋白的相互作用对骨髓中造血细胞及循环白细胞的迁徙有非常重要的作用。我们研究了VEGFR1+细胞是否表达可能促进其与转移前壁龛相互作用的整合蛋白。结果发现VEGFR1+的HPCsbiaoda VLA-4，这提示VLA-4 可能允许BMDCs粘附并形成转移前壁龛。该
13、细胞集群形成后，47、64整合蛋白都开始显著表达。蛋白酶，包括MMP9（基质金属蛋白酶9）也由造血细胞产生，它可以破坏基底膜，通过释放可溶解的kit配基和VEGF-A来支持新来的表达c-kit（CD117）的细胞，从而选择定居的微环境。当41新哈与纤连蛋白结合，可增强金属蛋白酶的表达；MMP9在转移前集群中表达上调可能是由于VEGFR1+的HPCs细胞中整合蛋白的结合和激活。这些结果是在之前对EGFR1 介导的 MMP9导致了肺转移的认识上的扩展。祖细胞促进肿瘤的生长，而Id基因（分化抑制基因）在祖细胞移动过程中非常重要，而我们再集群中也恰恰观察到了Id3的表达。Id3可能对VEGFR1+细胞
14、向转移前壁龛的移动有促进作用。林外，某些整合蛋白的表达也受到Id3基因的调节，Id3 也可能对BMDC 和基质细胞的相互作用、迁移及募集有关。为了证实这些蛋白在建立转移前壁龛中的作用，我们利用抗整合蛋白4抗体抑制VLA-A的表达或者敲除小鼠体内MMP9 和Id3，进而研究 VEGFR1+细胞集群的形成。在这些模型中，发现集群减少；转移扩散也发生在肿瘤接种后3周。接种之后，在Id3敲除的小鼠体内发现VEGFR1+HPCs移动至循环的能力相对于野生型有所削弱（654 versus 3283） ，这也可以解释同屋体内观察到的转移减少的现象。5为了验证野生VEGFR1+HPCs在Id3敲除的小鼠体内具
15、有恢复转移的潜能，我们将具有完整Id3的VEGFR1+HPCs子静脉注入Id3敲除的患瘤的小鼠体内。肿瘤接种21天时，VEGFR1+HPCs就重建了集群并形成了为转移。同样，LLC的转移也与GPF+BMDCs显著相关。这些发现进一步突出了 VEGFR1+BMDCs在建立集群及转移中的功能。纤连蛋白上调促进VLA-4+BMDCs的粘附我们进一步了研究了组织特异性配基对BMDCs粘附及其集群形成的支持作用。LLC细胞接种后，VLA-4+VEGFR+BMDCs归巢之前的第3至14天内，在将来转移灶附近，出现纤连蛋白的表达上调。此外，原发肿瘤存在是，局部固有成纤维细胞样基质细胞的增殖可能对纤连蛋白在局
16、部的浓聚有促进作用。恶黑在肺内也能引起与LLC相似的纤连蛋白表达升高，且在MCM影响下 ，多个组织内，例如肠道和输卵管，都有显著的纤连蛋白表达；这与B16更具侵袭力的转移潜能是相符合的。VEGFR1+细胞促进肿瘤粘附及生长为了证实VEGFR1+ 祖细胞促进循环肿瘤细胞的区划及粘附。我们分离并用红色荧光标记了(PKH26-Gl)患癌小鼠的VEGFR1+细胞。经过一个小时在试管内与绿色荧光标记(PKH2-GL) 的 B16或者LLC细胞共孵化，发现 HPCs聚集、增殖（150%）并促进了肿瘤细胞的粘附和增殖。相反，如果之前将VEGFR1+HPCs与抗VEGFR1抗体或抗VLA-4抗体共培养，则会阻断这种密切关系及扩增。运用细胞体外迁移能力分析技术，发现肿瘤细胞在VEGFR1+显示出比在VEGFR1-及单纯培养中更强的运动能力。SDF-1/CXCR4趋化因子轴决定了HPCs的归巢或者在骨髓中的居留。表达CXCR4 的特殊的肿瘤类型可能也可根据局部的趋化因子浓度进行迁移，在完全成型的具有VEGFR1+细胞的转移
